实验干货 | 小鼠BMDM提取详细步骤

生物科研实验室

在细胞生物学研究中，原代BMDM（骨髓来源巨噬细胞）的提取是一项基础且关键的技术。下面就为大家详细解读这一过程。

一、实验前准备
1. 实验动物与材料：选用体重在18 - 20g的C57BL - 6J小鼠，同时准备M - CSF、DMEM培养基、双抗、胎牛血清、75%乙醇溶液、PBS缓冲液以及0.22μm滤头。


2. 器械灭菌：将眼科剪、弯镊子和直镊子进行高压灭菌，确保实验器械无菌。


3. 材料预冷：提前一天将高糖DMEM、灭菌PBS、FBS、双抗放入四度冰箱预冷。


4. 溶液配制：准备50mL PBS（用于3 - 4只小鼠），含1%双抗的高糖DMEM，75%乙醇以及用滤头过滤的15mL左右1xPBS。


5. 物品紫外灭菌：准备充足的5mL、1mL注射器，提前盛有PBS的培养皿，1mL移液器及枪头，培养瓶，大量15mL和50mL离心管，泡沫板，若干针头和酒精棉球，进行紫外灭菌处理。

二、骨髓巨噬细胞的分离
取腿骨
1. 小鼠处死与消毒：用脊髓脱臼法处死小鼠，将其浸泡在75%乙醇中浸透消毒。
2. 骨骼获取：转移至超净工作台，固定小鼠上肢，从腹部中线剪开，取出双侧股骨和胫骨，并仔细剔除骨上附着的肌肉和组织，注意保持骨头完整性。
3. 骨骼消毒与清洗：将去皮去肉的股骨、胫骨放入含75%乙醇的培养皿浸泡5min，随后用冷PBS浸泡5min，洗去表面乙醇。

骨髓巨噬细胞提取和诱导
1. 骨髓吹出：将清洗后的股骨、胫骨两端剪断，用1 - 2mL注射器吸取PBS将骨髓吹至15mL离心管，反复吹洗3次，直至骨内无明显红色。
2. 红细胞裂解：1000rpm/min离心5min，弃上清。室温下加2mL裂红重悬细胞，轻弹管底，静置5min后加10mL PBS中和裂红。

3. 细胞清洗与重悬：1000rpm/min离心5min弃上清，PBS清洗两次，加入含M - CSF的完配混悬细胞沉淀，必要时重复操作减少细胞团块红色部分。
4. 培养基配制：为六孔板配制含10ng/ml M - CFS的培养基，六孔板每孔2mL，多配至12.5ml，加入12.5uL的10ug/mL的M - CSF。
5. 细胞重悬与计数：离心好的细胞弃去PBS，用12.5ml DMEM完全培养基重悬并反复吹打40下左右吹散细胞团，吸取10uL计数。
6. 铺板培养：根据计数结果，12孔板每孔种200万细胞。六孔板每孔先加2mL含10ng/mL M - CSF的DMEM完全培养基，再加入相应细胞数，置于37℃、5%的CO₂培养箱培养，记为第0天。

7. 换液培养：培养至第3天进行半量换液，补含10ng/mL M - CSF的DMEM完全培养基。之后每隔2 - 3天更换新鲜培养基，加培养基前用PBS清洗细胞，培养至第6天获得小鼠BMDM。