ELISA 基本原理及步骤

强强

        ELISA技术于20世纪70年代初由荷兰学者VanWeeman和Schurrs与瑞典学者Engvall和Perlman几乎同时提出。最初，ELISA主要用于病毒、细菌的检测。20世纪70年代末，它开始广泛应用于抗原、抗体的定性和定量测定，包括一些药物、激素、毒素等半抗原分子的定量检测。由于ELISA检测对仪器要求低，操作简便，特别是样品前处理简单，易于推广，且具有准确、灵敏、快速、特异、经济等优点，日益成为众多领域分析技术研究的热点。

    ELISA原理

    ELISA的基础是抗原或抗体的固相吸附和酶标记。固相载体表面的抗原或抗体仍然保留其免疫活性，而酶标记的抗原或抗体则同时保留了其免疫活性和酶的活性。测定时，待测标本（即其中所含的待测抗体）与固相载体表面的抗原或抗体发生反应。通过洗涤，固相载体上形成的抗原抗体复合物可以与液体中的其他物质分离，然后加入酶标记的抗原或抗体，该抗原或抗体也通过反应结合到固相载体上。此时，固相上的酶量与标本中待测物的含量成一定比例。加入酶反应底物后，底物在酶的催化下生成有色产物。产物的量与标本中待测物的含量直接相关，因此可以根据颜色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率高，间接放大了免疫反应的结果，使检测方法更加灵敏。可根据试剂来源、标本情况和检测的具体条件，设计不同类型的检测方法。

    ELISA实验技巧

    1.加样

    ELISA中最常见的操作是加样，涉及到每个步骤。目前一般使用移液枪加样，将规定的量加入到板孔中。加样时，首先要注意将加入的物质加入到板孔底部，避免加入到孔壁的上部，并且不要喷溅或产生气泡。加入不同物质时应更换喷嘴，避免交叉污染。

    另外，显色时最好使用多通道移液枪快速完成加液过程，因为显色对时间要求较高，最好同时显色，加液时间越均匀，结果误差越小。

    2.稀释

    ELISA实验中，准确的稀释操作非常重要。为了获得可靠的结果，应该使用同一型号的微量移液器和吸头，并在试管或其他合适的容器中进行稀释，确保混合均匀后，再将稀释后的液体加入到板孔中。避免在板孔中直接稀释，以减少误差和交叉污染的风险。

    3.洗涤

    在ELISA过程中，洗涤虽然不是反应步骤，但也决定了实验的成败。ELISA依靠洗涤来分离游离和结合的酶标记，去除残留在板孔中的未与固相抗原或抗体结合的物质，以及反应过程中非特异性吸附到固相载体上的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍存在的，这种非特异性吸附的干扰物质应在洗涤过程中洗掉。可以说，在ELISA操作中，洗涤是最重要的关键技术，应引起操作者的高度重视。操作者应严格按照要求进行洗涤，掌握洗涤技术，确保洗涤液充满每个孔。洗板后，最好在吸水纸上轻轻拍干（选择干净、无尘或少吸尘的材质），并严格遵守洗涤时间。

    4.显色

    显色是ELISA反应的最后一步，酶催化无色底物生成有色产物。反应温度和时间也是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可以保持无色，而阳性孔则随着时间的推移颜色逐渐加深。适当提高温度有助于加快显色。定量测定时，加入底物后的反应温度和时间应尽可能准确。定性测定的显色可在室温下进行，时间一般无需严格控制。有时可根据阳性对照孔和阴性对照孔的显**况，适当缩短或延长反应时间，并及时判断。

    5.数据读取

    比色前应先用干净的吸水纸吸干酶标板底部附着的液体，以减少对比色的干扰，然后将酶标板正确放入酶标仪的比色架上。酶标仪应放置在避光环境中，操作温度为15～30℃。使用前应将酶标仪预热15～30分钟，以使结果更稳定。原文网址：https://www.mlbio.cn/article-3374.html