干货｜WB-提动物组织蛋白的操作流程及注意事项

生物科研实验室

一、操作流程  1. 提前配置含有磷酸酶抑制剂的裂解液，按照 RIPA:FMSF(100:1) 的比例混合，随后放置在冰上备用，确保其处于低温稳定状态。
2. 准备适量的生理盐水，并同样放置在冰上，保证其低温条件，以备后续使用。
3. 在研磨管中放入研磨珠，以鼠脑为例，建议放入 4 颗 3mm 的研磨珠，同时在瓶盖上做好标记，确保样本的可追溯性。
4. 对组织进行称重，切成小块后放入研磨管。为保证样本纯净，可提前用预冷的 PBS 冲洗组织块 3 - 5 次，以清除表面血迹，之后用滤纸吸取多余水分。
5. 加入预冷且配好的裂解液，这里有两种常用方法。其一，在 250mg 组织中加入 1ml 配好的裂解液；其二，按照组织重量（mg）×5 = 配好的裂解液（μl）的比例加入裂解液，随后再加入等量的生理盐水稀释。例如，对于 30mg 的组织，需加入 150μl 配好的裂解液和 150μl 生理盐水。具体比例应以产品说明书推荐为准。
6. 使用研磨机在 4℃条件下，对组织进行研磨，每次 60 秒，共研磨 3 次，直至组织完全匀浆，确保组织细胞充分破碎。
7. 准备一套 EP 管并做好标记，使用移液枪将组织匀浆吸出转移至 EP 管中。
8. 将装有组织匀浆的 EP 管放置在冰上静置 30 分钟，使组织完全裂解。期间可每 10 分钟震荡一次，每次震荡 30 秒 - 1 分钟，促进裂解过程。
9. 充分裂解后，将样本在 4℃、12000rpm 的条件下离心 25 分钟，使蛋白与其他杂质分离。
10. 准备另一套做好标记的 EP 管，用移液枪迅速吸出上清液，立即转入新的离心管中。这些上清液含有我们所需的蛋白质，可置于 -80℃保存，或者直接进行后续的蛋白定量及 Loading 步骤。   二、注意事项 1. 取样人员务必佩戴手套、口罩和头套进行取材操作，防止角蛋白污染样本。同时，特别要注意避免 PEG 等聚合物污染，因为这些污染物会严重影响后续的蛋白检测效果。
2. 样本从采集到制备、分离直至冻存的整个过程，都应尽可能迅速完成。操作时间过长可能会对样品产生不良影响，导至蛋白性质改变。
3. 取样部位必须具有代表性，对于病变组织和对照组织要准确分离。对于高异质性组织，如脑组织，需精确到具体脑区取材，以确保实验结果的准确性。
4. 各组样本在取材部位、时间以及处理过程等方面，都应尽可能保持一致。任何不一致都可能影响实验结果的可信度，导至实验结论偏差。
5. 样本离体后，若存在分离步骤，必须在低温环境下进行。分离好的样品应立即置于液氮、干冰或 -80℃冰箱中，并在后续实验前始终保持在 -80℃以下，防止蛋白降解。
6. 取材时要按照实验方案做好分装，避免样本反复冻融。反复冻融极易导至蛋白质降解，影响实验效果。
7. 推荐使用进口大品牌的厚壁离心管或冻存管收集样本，这样既能避免聚合物污染，又能防止在运输和操作过程中样本管破裂。对于特殊样品，可采用干净的锡箔纸包裹后装在自封袋中，并将标记贴在自封袋上。