基于纳米孔的ELISA，检出限低至0.03fg/ml，同时检测6种标志物

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生物标志物检测是癌症诊断的重要工具，能够识别疾病特异性分子，用于早期发现、预后和治疗监测。酶联免疫吸附测定（ELISA）是常规使用的生物标志物检测方法之一，但也有几个局限性：半定量，检测限不足（纳摩尔），缺乏多重检测能力。纳米孔传感是一种用于检测单个分子而不需要标记的单分子技术。纳米孔传感器为分子传感提供了几个优势，如单分子灵敏度、无标签检测、实时分析、定量测量、高通量和便携性。然而，当应用于液体活检中的生物标志物检测时，该方法的稳健性和检测能力在复杂的实际样品中同时检测多种分析物仍然具有挑战性。
近日，杂志Nature Nanotechnology上发表了一篇题为“Nanopore-based enzyme-linked immunosorbent assay for cancer biomarker detection”的文章。在这项工作中，作者将纳米孔传感技术与酶联免疫吸附试验相结合，开发了一种基于纳米孔的酶联免疫吸附试验（NELISA）。NELISA实现了高效的检测性能，具有高定量精度、低LOD和高特异性。使用不同的肽探针，还能在一个纳米孔内同时检测多个生物标志物。该方法的检出限低至0.03 fg ml-1，可同时检测血液样本中的6种生物标志物。总体而言，基于纳米孔的ELISA具有高灵敏度和多重检测能力，适用于下一代诊断和即时检测应用。



图片来源：Nature nanotechnology

主要内容
1
三明治结构的NELISA抗原检测原理

通过简单的血液离心获得含有抗原的血清样品，将血清样品添加到有捕获抗体的孔板中，并与随后加入的酶标记检测抗体形成三明治结构。洗涤后，将肽探针引入孔中与酶相互作用。最后，收集样品溶液进行纳米孔易位实验。NELISA最关键的是使用了肽探针，它含有与检测抗体相关的酶的催化位点，可以通过纳米孔进行易位，从而在酶消化前后产生特征信号。



夹心NELISA抗原检测示意图
图片来源：Nature nanotechnology

2
NELISA对CA19-9、CEA和AFP的定量

作者选择了三种常用的酶：碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶，分别与CA19-9、CEA和AFP的检测抗体连接，并设计并合成了含有这些酶裂解位点的肽探针。NELISA对CA19-9、CEA和AFP的定量结果显示（图b、d、f），这三种生物标志物的线性检测范围超过6个数量级。LOD达到相当低的水平，CA19-9为5.0 mU ml-1， CEA为100 fg ml-1， AFP为20 pg ml-1。且只有匹配的抗原才会产生电流信号频率的变化，表明对生物标志物的检测具有很高的选择性。
为了在单个样品中同时检测不同的生物标志物，需要能够区分9种肽探针的易位信号的电流轨迹。为了识别这些信号，作者尝试开发一种机器学习算法，结果显示，支持向量机（SVM）能够高精度区分这9种肽探针，准确率几乎为100%。



NELISA对CA19-9、CEA和AFP的定量
图片来源：Nature nanotechnology

3
竞争性NELISA对抗体进行定量

为了验证NELISA是否可以用于检测抗体生物标志物，作者开发了一种检测乙型肝炎病毒核心抗体（抗HBc）的竞争性测定方法。抗HBc样品与HRP偶联抗HBc一起加入到包被抗原的孔板中。孵育并洗板后，加入底物H2O2孵育60分钟。再加入肽探针与剩余的H2O2发生反应，并进行纳米孔测量。结果显示，检测范围跨越7个数量级，LOD达到3.2 fg ml-1，是报道过的最低值之一（图c）。



竞争性NELISA抗体检测示意图
图片来源：Nature nanotechnology

4
临床样品中生物标志物的同步检测

作者收集了54名健康参与者和57名癌症患者的血液样本，将使用NELISA对血液样本中CA19-9， CEA和AFP进行同步定量。结果显示，所有三种生物标志物的纳米孔测量值与临床检测值密切匹配（图e-g），两种方法的检测结果具有较高的一致性。此外，使用NELISA和化学发光免疫分析法比较了三种生物标志物的LOD测量值（图h-j）。结果表明，NELISA获得的LOD比化学发光免疫分析法低2 - 4个数量级。



临床样品中生物标志物的同步检测
图片来源：Nature nanotechnology

总结与讨论
在这项研究中，作者建立了一种基于纳米孔的检测癌症生物标志物的ELISA。该方法的检出限低至0.03 fg ml-1，可同时检测血液样本中的6种生物标志物，包括抗原和抗体生物标志物。总体而言，基于纳米孔的ELISA具有高灵敏度和多重检测能力，适用于下一代诊断和即时检测应用。
与化学发光免疫分析法相比，NELISA采用电信号作为输出方式，有效解决了光信号之间的信号串扰问题。此外，NELISA还有其他几个明显的优势。首先，由于肽探针的稳定性、可重复性和低电流信号干扰，纳米孔测量允许对所有已知生物标志物进行足够低LOD值的生物标志物的精确定量。其次，能够同时检测多达六种生物标志物，具有精确的定量和极低的检测限。第三，纳米孔装置高度便携，适合在资源有限的地区进行现场测试。总的来说，NELISA可以检测临床血液样本中的各种癌症生物标志物，并有可能作为许多不同疾病的诊断工具。再加上自动化技术，在这项工作中开发的NELISA有望成为下一代诊断工具和护理点测试的强大竞争对手。

来源：小桔灯网丨作者：动力彩虹

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