手把手教学——荧光定量PCR全流程实验步骤和注意事项

临床医师

如果你的研究课题要接触荧光定量PCR实验，那么本篇文章将非常适合你，因为作者从实验设计到数据分析，以及每一步的注意事项都写得很详细和到位。推荐给每一位有需要的同学收藏和阅读！


1 总述实时荧光定量PCR（后续简称为qPCR）顾名思义就是在PCR反应体系中加入荧光物质，通过荧光信号的实时接收监测PCR反应进程，由于其模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，以此为依据进而达到定量的目的。
简单来讲，qPCR可分为荧光染料法（以SYBR GreenⅠ最常用）与荧光探针法（TaqMan 探针）两种，而其结果分析方法也有绝对定量和相对定量之分。在此不一一赘述，此次分享以SYBR GreenⅠ法为例，结果分析选用相对定量法。
2 实验设计2.1 总述——为什么要进行实验设计实验设计是科学研究中重要一环，好的实验设计在确保实验严谨有序进行的同时也为研究者差缺补漏、原始数据的保存、实验条件的优化等提供了便利，因此，在开始实验前做好实验设计是很有必要的。
2.2 如何做好实验设计想要做好实验设计，实验前的准备工作是十分关键的，对实验流程越熟悉，逻辑上越成环，实验设计也会越发巧妙和完备，以我个人经验来说，做好实验设计需要从以下几方面入手：

• 全面充分地了解实验原理，掌握实验背后的底层逻辑；
  
• 熟悉实验的规范化操作流程，从一开始就养成规范操作的习惯（注：这点非常重要，有的同学可能做实验的时候马马虎虎，只追求结果，实验做出来了却连规范化的实验怎么做都不清楚，稀里糊涂的，还有可能把别人带“坑”里，查原始数据才发现实验都是错的，瞎折腾）；
  
• 尽可能地了解你所用到的实验设备和试剂，当然也要对比别的同学所用耗材，事无巨细，这是我们查找实验问题最关键的一步（注：此步在实验设计阶段尽可能有个大致了解，具体了解基本上是等实验正式开始真正用到了，但最起码得知道要用到什么东西吧）；
  
• 养成做好实验记录的好习惯：好记性不如烂笔头，最初实验设计是咋样的，后续进行了怎样的优化等等，越详细越好，任何一个被忽略掉的细节都有可能导致实验失败哦；
  
• 好的实验设计关键在于“灵活”，能保证条件随处可调的同时却不打乱实验节奏！
  

2.3 实操环节——RT-qRCR实验设计（注：此处以最基本的两组（实验组、对照组）三样本为例做一演示，其他增加组别或者增大样本量什么的都是在此基础上的衍生，要活学活用哦！）背景假设：倘若要用RT-qRCR实验看A、B、C、D四个基因的相对表达量，并以此进行实验设计。
2.3.1 实验前准备：提取三个样本的RNA并逆转录得到三个样本的cDNA。（注：a. 要确保逆转录得到的cDNA量要满足此次实验的需要，当然别忘了把预实验的用量也包含在内哦；b. 为尽可能消除个体差异带来的影响（组织），可以在提取RNA的时候将组织多混一，如5个组织各取一些混在一管提取RNA作为样本1等）
2.3.2 计算：我们首先要通过预实验看其熔解曲线（用于判断引物特异性）、Ct值（即大致表达情况）、模板的稀释倍数等情况。注：本人所用qRCR的反应体系如下：

• 模板（cDNA）：2ul；
  
• 上游（下游）引物：0.4ul；
  
• 无酶水：7.2ul；
  
• 预混液Mix：10ul；
  
• 总体积：20ul
  

4个基因，在不知道稀释倍数如何的情况下可以多设置几个稀释梯度，如：原液、5倍、10倍、20倍等等，当然有经验值是最好不过了，比如我们课题组所做基因基本稀释3倍、5倍基本可以，故而实验设计如下：


注：新手若没有经验值的情况下，最好先严格按照试剂说明书来操作，后续再进行下一步调整哦！按照所需量，稀释各样本（注：不可将原液一次性稀释哦，用多少取多少）此处需要考虑两个要素：1 A基因模板不同稀释倍数各需两孔，为避免加样挂壁导致样本不够，可以多算一两孔，如：A基因原本需要2（模板量）×2（孔数）=4ul，那现在就变成2（模板量）×4（孔数）=8ul。2 我们有3个样本，但不能在预实验的时候只用一个样本来做，这样会造成后期正式实验的时候出现某个样本用完的情况，那就有两个思路：

• A基因用样本1做，B基因用样本2做，依次类推；
  
• 每个基因的不同稀释梯度分别用样本1/2/3来做，但要注意调换哦，因为原液用量肯定大，所以4个基因原液要都用样本1那样本1肯定在正式实验开始前就被用完了；
  
• 要注意新手对内参基因不熟悉的情况下最好也做预实验。
  

其他基因行同样的操作哦（小tip：新手怕条件太多加错样，最好不要怕麻烦写个小纸条哦；也可将相同的组分先混合，然后再加不同组分，这样不但能提高加样速度，而且还会减少多次加样带来的加样误差，加样组分变少，也不易出错）
注：理想状态下，模板浓度增加10倍，Ct值减小3.32，但实验过程中由于受到加样误差、反应条件等多方面的影响，有可能出现Ct值不变或者不降反增的情况，所以要在调整实验时具体问题具体分析。

2.3.3 预实验结果解析：预实验结果的判读极其重要，首先判断熔解曲线是否单峰，单峰即代表引物特异性可以，该引物可用；其次看Ct值，是否在15-30之间，若要更加严格的话可以控制在15-25，表达量太低着实也没有研究的必要了。熔解曲线与Ct值均可的话代表可以进行正式实验，若二者有一者不太好则需要优化实验条件，即：A 熔解曲线双峰：a. 杂峰在主峰之前，即代表有引物二聚体的存在，此种情况下大概率需要重新设计引物了，改变条件对其影响不大（如图1）；b. 杂峰在主峰之后，大多由非特异性扩增引起，可通过调整稀释倍数、减少引物等来进行调整（如图2）；


图1


图2B Ct值：a. 过大：通过提高模板浓度等进行改善；b. 过小：通过稀释模板等进行改善。注：实验条件的改善有很多方面，不仅局限于上述提到的几个哦。
2.3.4 预实验结果记录：我一般是按照加样的孔进行记录（注：记录的目的在于理清实验思路，做好原始记录以及方便实验调整，根据自己的习惯和方式来记录即可）：


我习惯用符号记录，“√”代表可以进行预实验；“×”代表需要重新设计引物；“☑”则代表可以微调，一般会在表格后方再加一列以注明如何调整，至此，A-D基因的预实验完成，按照两组三样本三次平行重复来讲，96孔板可放下4个基因，由此衍生出以下实验设计思路：4个基因部分可以部分不可以，或者可以做正式实验的两个基因不同稀释倍数，如：A与B可以，C与D不行，或者A稀释3倍进行正式，而B需要稀释5倍。此时，可以先将A与B做在同一板上，剩余的孔用于其他基因C/D/E/F等的预实验，即正式实验+预实验；或者先将A/B待定，其他基因的预实验一板全上完，然后凑正式（注：基因少的情况下最好选前者，总之灵活选择，并没有固定模式）。
2.3.5 布板：顾名思义就是你的样本在96孔板上如何加的问题，尤其是正式实验的时候，巧妙的布板方式省时省力。主体思路就是先加大体积后加小体积，相同组分先混合再加样，最后加不同组分（一定要注意组分一定要混合均匀），至于样本如何放置，则比较灵活，按个人习惯就行，但需注意目的基因和内参基因一定要在同一板上，且要保证模板的稀释倍数一致，否则无意义。
3 数据处理及统计分析
3.1 背景介绍

实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR，qPCR）的数据分析主要有绝对定量法和相对定量法两种方法。
所谓绝对定量法，即对未知样品的拷贝数进行测定的方法，如血样中的病毒、支原体、衣原体的定量分析、食品中某一转基因成分的含量分析等。
而相对定量法主要是以某一内参基因做对照，进而比较两个或多个样本之间某一目的基因表达量的差异，常用于检测mRNA表达量的变化，以及在不同组织中mRNA表达量的差异等。其中，相对定量法是最常用的方法，其数据处理又包含双标准曲线法和2－△△Ct 法两种，并以2－△△Ct法最为常用。
因此，接下来主要围绕相对定量法中的2－△△Ct法简要介绍qPCR的数据分析过程，并进一步通过GraphPad Prism 8.0对统计分析及绘图作一简单介绍。
3.2 相对定量法
(1)目的基因Ct值的归一化：
   ΔCt（实验组）=Ct（实验组的目的基因）-Ct（实验组的内参基因）
   ΔCt（对照组）=Ct（对照组的目的基因）-Ct（对照组的内参基因）
(2)实验组ΔCt的归一化：ΔΔCt=各样本的ΔCt-对照组的ΔCt
(3)表达水平的差异倍数：2 –ΔΔCT
3.3 数据处理及统计分析
(1)qPCR结束，得到原始数据，粘贴到Excel表格中，仅保留位置及Cq值（注：Ct值与Cq值表达的意思基本一致，实验指南建议用Cq值来命名，所以不必纠结两者的名称，同等看待即可；此外，一定要明确自己的加样位置，以防分析出错）；


(2)我们一般在实验中会设置复孔，所以第一步先求其平均值；
(3)第二步：计算ΔCt，用目的基因的Ct值减去内参基因的Ct值；


(4)第三步：计算对照组ΔCt的平均值；
(5)第四步：计算ΔΔCt，用ΔCt值减去对照组ΔCt的平均值即可；


(6)第五步：计算2–ΔΔCT（注：数据的排布方式可以按照个人习惯自由布局，另外样本较多时也仅需在此基础上添加即可，灵活变换哦）；


(7)复制粘贴2–ΔΔCT值为数据模式，打开GraphPad Prism 8.0，新建Column（注：此处以两组间比较为例）；


(8)复制粘贴数据至GraphPad Prism 8.0，点击Analyze，选择Normality and Lognormality Tests进行正态性检验，默认选项，点击OK，即可得到正态性检验结果；




(9)返回Table，点击t Tests，进行t检验 ；


(10)方差齐性检验：默认方差齐，方差不齐时返回Table，再次进行t检验，此时注意勾选第二个，即可得到统计结果。


(11)绘图：点击侧面Graphs里面的Data1（注：文件名都是可以重新命名的），即可生成图片；


(12)图片的美化及相关信息完善：此步操作简单，双击即可弹出格式设置窗口，按个人喜好选择即可，但仍需强调的是，一定要展示统计分析结果添加星号哦！
(13)全部处理完成，点击File→Export即可输出图片，还可以根据需要更改图片格式哦！（注：最好保留原始格式，这样后期只需要修改即可，无需再次分析和作图）

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