📍 Western Blot条带常见问题总结！解决你的实验困扰，精准解析每个问题！

风云

Western Blot实验中遇到条带问题？不慌，这里有你最常见问题的解决方案！


     01背景脏
原因1:洗膜不充分，洗膜时间不够解决办法1:至少5minX4次或10minX3次，最好是15minX3次
原因2:封闭不彻底
解决办法2:选用合适的5%脱脂奶粉用tbst配制或用BSA(磷酸化指标)封闭1小时，可回收利用，但不要用太多次和放太久。也可选用无蛋白快速封闭液封闭10-15分钟
原因3:抗体浓度不合适
解决方法3:一抗二抗按说明书使用，选择合适的稀释倍数
原因4:印迹膜被污染
解决方法4:全程戴手套，防止污染，剪膜画线时注意不要画到膜上，tbst多洗一会儿原因5:转膜时膜上有气泡解决方法5:转膜时将气泡排除干净


      02高背景
原因1:-二抗浓度过高解决方法1:稀释抗体浓度原因2:抗体失效
解决方法2:更换新的抗体
原因3:膜的问题
解决方法3:防止膜过程中干燥，使用nc膜，使用干
净镊子并戴手套操作
原因4:洗膜不充分
解决方法4:适当增加洗膜时间和次数，确保充分震荡，并保证抗体充分覆盖膜表面
原因5:曝光过度
解决方法5:缩短曝光时间原因6:转膜液封闭液不新鲜或污染解决方法6:现配现用


       03非特异性条带较多
原因1:抗体浓度过高，上样量过高
解决方法1:降低上样量，提高一抗稀释浓度原因2:抗体未纯化
解决方法2:使用单克隆抗体
原因3:转膜强度太强
解决方法3:降低转膜强度(时间和电流)原因4:抗体与蛋白非特异性结合
解决方法4:更换抗体
原因5:封闭不完全
解决方法5:增加封闭液中蛋白浓度
原因6:细胞传代次数过多，导致蛋白表达模式分化解决方法6:选择原代或传代少的细胞株，和现在的细胞株一起做参考


        04条带反白
原因1:一抗浓度过高，导致底物消耗过快解决方法1:稀释一抗浓度原因2:化学发光液灵敏度太高解决方法2:减少曝光时间和选择合适的化学发光液


       05条带未完全显示
原因1:上样量不够、样本失效解决方法1:增加上样量，换一批样本原因2:转膜时没夹紧，转膜没转上解决方法2:更换转膜槽


      06条带扭曲，不平整
原因1:插拔梳子时，电泳梳子形成的泳道不平整解决方法1:用注射针拨正泳道原因2:凝胶制备不均一
解决方法2:选择合适的制胶试剂盒原因3:浓缩胶电压偏高，导致浓缩效果不太好
解决方法3:降低电泳电压原因4:样本有不溶性颗粒或核酸污染解决方法4:制备样本时离心要充分，去除杂质。实验器材需整洁

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