光定量PCR——实验全解析

大v

一、QPCR 的概念



定义：
在PCR反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号积累实时监测PCR过程，最终通过相对定量或绝对定量方法确定样本中的表达量。
原理：
利用荧光信号的变化来反映DNA的扩增过程。荧光信号与DNA的量成正比，通过检测荧光强度的变化来确定DNA的扩增情况。
二、QPCR的应用

绝对定量：用于精确测量样本中目标基因的拷贝数，常见于病原体检测（如病毒载量测定）、转基因食品检测、基因表达研究等。
相对定量：用于比较不同样本中目标基因的表达水平，常用于基因表达分析、RNA干扰效果验证、基因芯片结果验证等。
三、QPCR的分类




染料法（如SYBR Green）

优点：操作简便、成本低。
缺点：无模板特异性，需要进行熔解曲线分析，灵敏度相对较低。
应用：基因表达分析、RNA干扰效果验证。



探针法（如TaqMan探针）

优点：特异性高、重复性好、荧光信号强。
缺点：成本高，需要针对特定目标设计探针。
应用：基因拷贝数测定、临床诊断（如病毒定量检测）。
四、QPCR的实验步骤




实验步骤



实验步骤

1、样本制备

RNA提取方法：常见的有Trizol法和CTAB法。Trizol法适用于大多数样本，操作简便；CTAB法适用于富含蛋白质和多糖的样本。
RNA纯度和浓度检测：通过OD260/280比值评估纯度（1.8-2.1为佳），通过琼脂糖凝胶电泳评估RNA完整性。
2、cDNA合成

逆转录体系：根据RNA的类型选择合适的引物（如oligo-dT或random primer）。
逆转录反应条件：通常为70℃反应5分钟，42℃反应60分钟，70℃反应10分钟。
3、引物设计

原则：避免引物二聚体，扩增片段长度80-300bp，跨内含子设计。
软件推荐：Primer3 Plus、Primer Bank。
4、QPCR检测

布板方式：每个样本设置多个重复孔，包括内参基因和目的基因。
反应体系：包括SYBR Green Mix、引物、cDNA模板等。
数据分析：常用2^(-ΔΔCT)方法进行相对定量分析。
五、QPCR的注意事项

1、扩增曲线和熔解曲线：

扩增曲线：应平滑完整，反映PCR循环数与荧光强度的关系。
熔解曲线：应为单一峰，反映引物扩增的特异性。



扩增曲线



溶解曲线

2、CT值：

定义：达到荧光阈值时的循环数。
特点：模板量多，CT值低；模板量少，CT值高。



CT值

3、反应体系配置：

避免反复冻融：特别是使用SYBR Green Mix。
混匀和离心：减少加样误差，去除气泡。
设置对照组：如NTC（无模板对照）验证污染情况。



反应体系配置-注意事项

好了，今日就分享到这里，希望对大家有帮助！

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