单细胞功能蛋白质组学微流体研究进展(下)

微流控芯片

3.用于基于靶向的单细胞蛋白质组学分析的微流体系统

在靶向蛋白质组学技术中，蛋白质是通过使用带有传感标签（如共轭荧光团、同位素标签或量子点）的亲和探针进行分析的，这些探针会发射或转导信号。为了实现高灵敏度并促进单细胞水平的靶向蛋白质组织学鉴定，微流体的使用越来越多，主要是因为它们提供了标记过程中更高的有效浓度、可控的细胞操作、大大减少的试剂消耗以及提高多路复用性和吞吐量的设计灵活性等优点。在下文中，我们回顾了微流体系统支持的基于靶向的SCP方法，特别关注了它们在过去5年的发展，因为它们的早期发展在之前的综述中已经讨论过。

3.1基于细胞计量学的单细胞方法

流式细胞术（FCM）是一种标准的分析技术，通过量化单个细胞的荧光发射和散射光，每秒可以计数和分析数千个细胞。使用FCM和荧光抗体来分析细胞中的蛋白质一直是生物科学的主流和广泛应用。然而，FCM的细胞内空间信息有限，通常需要数十到数百μL的样本量。当将流式细胞仪缩小到微流体尺寸时，多参数测量的带宽会受到损害，例如，在高通量设置（>2000个细胞/秒）下表征细胞形态是一项挑战。为了解决这个问题，成像流式细胞术（IFC）结合了高通量FCM和高分辨率成像显微镜的优势，实现了细胞信息丰富的检测（图3a）。此外，IFC与微流体的集成允许简单的光学实现和对细胞操作的精细控制。请注意，在大多数IFC微系统中，流体通量和光学检测之间的权衡为在高通量下获得体面的空间分辨率带来了挑战。为了解决这个问题，Holzner等人引入了使用多色荧光和亮场分析的多参数IFC，该方法能够高分辨率和高通量地提取细胞形态特征，如准确的细胞大小和检测人类细胞中的细胞质蛋白。该方法将频闪照明（即一种为高速运动的物体生成无模糊图像的技术）与弹性惯性3D细胞聚焦相结合，分别有效地控制流速和细胞定位，从而实现每秒104个细胞的采集率。

3.2微蚀刻法

微重力法利用亚纳升孔捕获细胞，细胞分泌的蛋白质被预处理的载玻片捕获，载玻片上涂有亲和探针（抗体或抗原）。Love等人开创了微重力生物芯片，其中微孔是通过沉积细胞悬浮液制备的，使细胞在去除多余的未被追踪的细胞之前沉淀下来（图3b）。然后将刻有抗体或抗原的载玻片贴在封闭的单细胞上，并通过荧光免疫测定法检测分泌的蛋白质。Schubert等人开发了一种单分子阵列（SiMoA）平台，该平台能够对单个细胞中的少量蛋白质进行计数。SiMoA表明，前列腺特异性抗原的表达在前列腺癌症细胞中不同，并随着基因漂移而变化。Jia等人探索了微雕刻方法来研究非人灵长类动物对蛋白质结合疫苗的纵向回忆反应。自首次亮相以来，不断努力提高微雕刻方法的灵敏度，推动了从单细胞中检测低丰度蛋白质。Li等人介绍了一种在蛋白质检测中使用微孔平台的信号放大方法，其中光学的轴向分辨率（即深度场）得到了提高，侧壁和边缘捕获的荧光标签也对信号做出了贡献。与仅从平面发出荧光的传统微重力方法相比，值得注意的是，边缘增强微孔免疫测定将灵敏度提高了6倍。增强荧光的另一种方法是用半导体量子点代替有机染料，半导体量子点可用作荧光报告器来检测单细胞分泌的蛋白质。总之，基于微孔的检测比传统的酶联免疫吸附斑点（ELISpot）检测具有更高的灵敏度。此外，这种方法还具有适用于下游分析的细胞分离等优点，并能够通过多抗体雕刻的载玻片对单细胞分泌体进行动力学研究。

3.3微流控毛细管电泳和单细胞蛋白质印迹

毛细管电泳（CE）是一种分析方法，其特点是使用高电场进行高分离效率和灵敏的离子检测。传统的CE存在分离时间长、样品消耗大和焦耳热耗散慢的问题。另一方面，微流体CE（MCE）能够解决这些局限性。MCE使用微通道在纳升尺度上对生物分子进行电泳分离，分析时间需要数十秒，可用于分离和检测从单细胞中提取的细胞内内容物。Huang等人开发了一种MCE，通过使用单分子荧光测量来检测单细胞中的低拷贝数（LCN）蛋白质。请注意，这种方法的吞吐量相对较低，多路复用能力有限。为了提高通量，Mainz等人利用光可编程和细胞可渗透的报告器同时分析单个细胞的激酶活性。 Li等人还提出了一种基于多色荧光检测的微流体装置，用于单细胞操作，该装置提供了有效的电泳分离，以实现多个小分子的同时检测。总体而言，MCE利用短距离和相对较短的时间尺度，可以快速完成传统CE中采取的所有步骤。

微流体中使用的另一种电泳方法是A.Herr小组开发的单细胞蛋白质印迹（scWB），其中特定蛋白质的鉴定和定量取决于它们通过与抗体探针结合的薄层凝胶基质的迁移（图3d）。scWB将蛋白质印迹与开放式微孔阵列相结合，从而提高了检测通量，并能够可靠地处理约2000个神经干细胞。请注意，scWB的早期发展主要集中在处理大量输入细胞，例如>1000个输入细胞，因此无法处理质量有限的输入细胞。为了解决这个问题，Sinkala等人将稀有细胞工作流程与scWB相结合，以分析单个循环肿瘤细胞（CTC）的蛋白质表达（复杂性=8）。具体来说，从患者血液中收集的细胞根据大小和变形性进行选择，对大有核细胞进行染色和鉴定，然后转移到微孔中。然后裂解这些细胞，将相关蛋白电泳注射到凝胶中，依次进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、印迹和免疫印迹步骤。最近，差异分级被整合到电泳分离中：特别是，J.Vlassakis等人通过电泳和免疫测定读数（SIFTER）引入了单细胞蛋白质相互作用分级，用于定量单细胞中的多聚体蛋白质复合物。在这项工作中，进行了双向电泳，单体和解聚的蛋白质复合物被分级并固定在微孔周围的凝胶区域，然后使用凝胶内免疫探针进行定量。除了高通量和负担得起的多重性的优点外，scWB还由于电泳分离而提高了抗体的特异性。

3.4液滴微流体

液滴微流体技术能够通过在纳升体积的液滴中用荧光探针进行液滴包封来定量单个细胞释放的分泌体，克服了微流体FCM无法检测分泌蛋白的技术限制。液滴微流控技术也被用于分析细胞内蛋白质，其中一到三个细胞在液滴形成之前被电裂解。丁等人最近使用共流液滴微流技术将原代细胞（取自组织）与捕获微珠和荧光标记抗原一起包封（图3e）。在液滴孵育过程中，所需的细胞（如B细胞）分泌第一抗体，以介导荧光团标记的抗原与微珠之间的结合。随后，通过荧光信号对被荧光抗原“标记”的所需液滴进行分选（图3e）。液滴微流控方法可实现高通量分析；然而，检测珠（在焦平面上）的排列使得对分泌的抗体进行定量变得具有挑战性。为了解决这个问题，通过在液滴产生后将热固性油的包封转化为固体来证明液滴的固定化。另一方面，Eyer等人引入了一种基于液滴的微流体技术（DropMAP），从固定在2D阵列上的液滴中引出单细胞分析。DropMAP能够实时测量以量化抗体分泌率、免疫亲和性和相关动力学。关于DropMAP的工作原理，包封了两个水相，其中一个包含细胞或校准抗体，另一个包含试剂（荧光标记和300 nm顺磁性纳米颗粒）。由于使用了纳米颗粒，抗体的结合能力得到了提高。当施加磁场时，纳米粒子（旨在捕获分泌的免疫球蛋白）交联，形成微米大小的聚集体。为了促进单个细胞在液滴内的封装并提高多路复用性，Khajvand等人将液滴微流体与抗体条形码集成在一起。使用约180 pL大小的腔室阵列来提高单细胞捕获效率（超过80%，存活率>90%），这种方法大大提高了固定液滴中单细胞的片上捕获、分离和长期培养。一般来说，基于液滴的微流体具有快速包封、提高靶浓度、减少样品之间的交叉污染以及桥接基因型和表型的能力。

4.基于质谱的全球单细胞蛋白质组学分析技术

已经投入了大量努力来提高非靶向蛋白质组学工作流程的灵敏度，以达到具有良好覆盖率、鲁棒性和可靠性的单细胞分辨率。与基于亲和力的方法相比，非靶向蛋白质组学分析允许对细胞蛋白质组进行全局映射，因此是面向发现的基础研究和临床研究的理想选择。各种样品制备方法、自动化仪器和LC-MS开发的最新进展使我们能够使用无标记方法对单个细胞中的1000多种蛋白质进行定量。在下文中，我们将讨论这些令人兴奋的发展，其中包括简要讨论用于单细胞分析的LC-MS系统的演变、微流体支持的上游样品处理以及随后的数据采集和分析工作流程（图4）。

5.SCP在生物学和临床研究中的应用

5.1靶向单细胞蛋白测定的应用

在本节中，我们介绍了各种基于微流体的靶向SCP检测的生物学和临床应用（图5。由于微流体的独特能力，它们对靶向SCP的实施促进了各种细胞生物学研究和临床研究。例如，CyTOF是靶向SCP分析最广泛使用的方法之一，提供了探索不同脑细胞中细胞表型的应用（基于信号标记物和细胞因子），免疫细胞分化，基于表面标记物的细胞异质性，和癌症相关信号。CyTOF与细胞成像相结合，也被应用于探索组织内或细胞过程中单个细胞中蛋白质的亚细胞分布，促进了我们对免疫细胞功能的理解，以用于免疫治疗应用。最近，Neuperger及其同事使用单细胞CyTOF进行了研究。基于13种蛋白质的表达模式的非小细胞肺癌细胞（NSCLC）系中的异质性和肺腺癌中的瘤内异质性。同样，SCBC方法用于测量各种分泌、细胞质或膜蛋白的多重蛋白质丰度（由细胞产生的拷贝数决定）。通过仔细选择和监测特定蛋白质标记的表达，SCBCs可以成为研究多种生物系统的工具。例如，异质性（细胞-细胞变异）可以通过监测参与不同信号通路的关键表型标记、转录因子和信号效应器的差异表达来解决。SCBC方法也被用于通过测量在近距离孵育的细胞释放的分泌蛋白来探索细胞相互作用和通信。这种方法用于了解细胞在不同分离条件下如何相互作用，以及信号蛋白如何影响相邻细胞。选择性蛋白质标记的SCBC分析确实已成为研究功能异质性、信号通路、细胞间相互作用、细胞通讯、免疫细胞反应、和CTC分析的有前景的工具。Su等人应用SCBC芯片监测了18种蛋白质，包括表型标记、转录因子、单个黑色素瘤细胞中的信号效应器，以探索药物诱导的信号动力学。这项研究揭示了黑色素瘤在BRAF抑制剂治疗下的表型转变，BRAF抑制剂激活了包括MEK/ERK和NF-κB在内的替代通路，进一步加速了肿瘤进展和耐药性。表型。此外，Ullal及其同事使用SCBC探索了肺腺癌患者的肿瘤间和肿瘤内异质性，并仔细选择了90个靶标记，以覆盖临床上使用的标志性途径（如DNA损伤、细胞死亡）和诊断标记。

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