cfDNA—分子检测技术的宠儿

虎威将军

血液中游离的DNA简称cfDNA（circulating free DNA），是指循环血液中的核酸类物质。包括循环血液中细胞内的核酸，游离的内源性脱氧核糖核酸和外源性DNA与RNA，如真菌血症、细菌血症和病毒血症等病理情形下的血中外源核酸。血液中cfDNA在疾病的早期诊断、预后、监测等方面具有重要潜在价值。其具体医学应用大致包括以下三方面：
1、产前诊断
2、免疫性疾病等非肿瘤类疾病的病情分析与疗效观察
3、肿瘤相关分析
在上述三类应用中，其在肿瘤分析中的价值尤为重要，虽然目前血液中cfDNA分析尚未列为临床必需的检测指标，但大量的研究论文和大量一期和二期临床试验的数据，有力支持这一新技术在肿瘤防治中的巨大应用价值。下面我们来介绍一下cfDNA的一些相关知识。

01、cfDNA的来源

01、外源的DNA，如病毒、细菌、真菌、，饮食中含有的核酸；

02、坏死（适合手术、外伤、器官移植对机体影响的研究）
在细胞能量产生和再生功能丧失的时候发生的偶发性细胞死亡，这时细胞会细胞器膨胀，碎裂，染色质融合, 以及非特殊性消化。细胞坏死比细胞程序性死亡发生得快，但是由于它产生的DNA是大片段的（～10000 bp），程序性死亡的片段（~140-200bp），所以坏死的细胞更难从机体里面移除。
03、外伤和手术
血浆DNA水平与外伤或者手术的严重程度和并发症成正比，细胞的死亡会导致血浆DNA水平的升高。血清里面DNA的浓度与手术前后某些酶浓度显著相关。在外伤过程中上升的mtDNA水平并不是细胞坏死造成的，它在术后7小时内下降，但会在术后至少5天保持上升。
04、移植器官
在器官移植过程中的手术以及排斥现象都会造成细胞坏死。因此，cfDNA会和细胞坏死的相同。(原因是细胞坏死，通过检测片段大小来确定细胞死亡原因)
05、细胞凋亡
细胞凋亡或许是最常见的cfDNA产生的机制。但是由于机体对这种死亡机制的清除作用是很高效的，因此它产生的cfDNA的半周期很短（利于随时检测机体的情况）。细胞凋亡的吞噬是一个非免疫的，非发炎的过程伴随着中性粒的募集。如果凋亡的细胞没有通过吞噬作用被清除（由于吞噬作用的错误摄入或者过量的细胞死亡，那么就会一直有细胞成分泄漏到环境中，就会产生发炎，暴露自身抗体和耐受性的扰乱）。伴随着升高的免疫力（通过切割，蛋白的交联和重新定位），自身抗原的暴露程序性坏死会产生自我免疫。这些抗原会递呈给Tcell，然后开始一个免疫反应。这种自然免疫会取决于经历凋亡的细胞种类，哪一种细胞去吞噬它，以及到底相关抗原有没有被识别。健康（锻炼）的人群以及孕妇并没有发炎和自我免疫反应。说明细胞凋亡并不是癌症或者其他疾病的主要来源。而且特定的癌细胞可以抵制凋亡继续繁殖，并伴随着cfDNA的增加。
06、细胞焦亡
细胞焦亡是促炎的，依靠caspase1程序性死亡的，会导致炎症因子：IL-1b, IL-18的释放。过程也是迅速的。表现为细胞膜皱缩，细胞核完整，显著的细胞核浓度，细胞膜上形成孔，细胞体积增加，促炎因子的释放。细胞焦亡不会引起线粒体降解和释放细胞色素，因此不会产生mtDNA的释放。（结合细胞形态以及炎症因子以及长度可以区别凋亡，焦亡，坏死，以及无法及时被吞噬的凋亡细胞造成的cfDNA上升）
07、主动地被释放的DNA
活细胞（健康细胞，肿瘤细胞，病变细胞）会释放DNA到环境里，但是死细胞不会。被释放的DNA不一定是被包裹着释放的，而是和某种复合体一起释放的。
08、核酸的胞外囊泡（extracellular vesicles）运输（癌症以及癌症进程）
胞外囊泡分为外泌体（30-100nm）、凋亡小体（<4000nm）、蛋白聚合物(40-490 nm)、大脂质体（500-1000nm）以及微泡(MV)(100-1000 nm)。外泌体是细胞间交流作用的。不同来源的外泌体中会含有转座元件，单链DNA，基因组DNA，mtDNA。血清中的cfDNA来自于外泌体。且93%的血浆DNA积聚于外泌体中。（也就是说其实ctDNA是主动释放的，而不是因为细胞死亡造成的）。脂质体转运原癌基因和癌症相关的信息。原癌小体是由以及变成阿米巴虫表型的癌细胞分泌而来。癌细胞也会分泌外泌体，使得体液中的肿瘤DNA水平上升，促进癌症进程。分泌EVs也是耗能且受调控的。EVs的包含物受环境以及来源细胞的影响。
09、红细胞细胞核摘除
红细胞在成熟的过程中会去掉细胞核，在去掉细胞核的过程中释放cfDNA。
10、NETosis （适合癌症，外源感染的研究）
这种现象仅限于特定的造血细胞。是快速的，类似于爆炸似的过程。这个过程包含了细胞核的分裂，细胞死亡，导致NET，积累抵抗性相关的物质以及入侵的微生物。巨噬作用对于预防炎症，自我免疫，不可避免的组织损伤有着重要作用。这个清除的过程会导致核酸降解。但是核酸并没有被完全降解，最终流入体液中。被巨噬作用吞噬的NET(中性粒的胞外陷阱)紧接着会被脂多糖刺激，导致促炎因子IL-1B, IL-6，和癌症坏死因子（TNFa）的释放，表明了巨噬作用为感染或者受伤做的准备。因此，巨噬作用可以被当成cfDNA的来源。它也被视为参与进或者诱导cfDNA的释放，例如炎症。



02、 cfDNA 释放的原因

（1）从死细胞或者活细胞中由吞噬-介导DNA的释放。细胞凋亡，但是需要吞噬细胞清除凋亡细胞，然后吞噬细胞死亡后将DNA释放出来。
（2）自噬（适合癌症研究）：细胞降解的清除：一般是清除细胞器，如果清除了核将会导致细胞死亡。线粒体的清除会释放mtDNA到血浆中。自噬作用与NETosis一样，早期抑制癌症，后期促进癌症。早期时会造成癌细胞的死亡。抑制自噬会增加癌症的风险。所以正常的自噬并不会直接导致cfDNA，但是在特殊的环境下也会导致cfDNA。
（3） 老化：90岁以上和年轻的人的总cfDNA,非甲基化cfDNA, RNase P-coding cfDNA 和Alu 重复的含量以及水平是不一样的。越高的cfDNA的总量和非甲基化cfDNA总量代表身体的力量越小，还代表意识损伤，下降的每日身体功能和灵活性。mtDNA的拷贝数只能代表身体机能上的衰弱。
（4）DNase的作用：在各种疾病以及癌症中，越低的cfDNA水平伴随着越高的DNase活性。但是不同来源的DNase会带来不同的清除以及释放效果。NET-在细菌，真菌，以及其他病原物中的抗性也是由DNase介导。胞外的核酸酶会导致NETs的DNA框架降解，最终释放到体液循环中。NET-抗性的病原体在病人感染中，会产生外源的和内源的cfDNA。
（5）脓毒症：超过800ng/ml cfDNA的脓毒症患者为重症患者。这部分患者的cfDNA一部分来源于宿主，另一部分来源于病菌的DNA，但是来自病菌的部分只有很少一部分。NET的形成会增加cfDNA的水平，特别是在NET-抗性的细菌侵入后。ROS也可以不依靠caspase激活中性粒细胞，导致NETs的释放。但是，也有报道cfDNA的升高并不一定是中性粒细胞的NETs导致的，而有可能是因为其他种类的细胞，因为体液中的H3组蛋白并没有增加。推测或许是因为坏死组织或者细胞凋亡。
（6）氧化压力：它参与很多疾病，心脏病，癌症，神经错乱，肥胖，关节炎， 老化，脓毒症。它会造成或者参与NETosis和细胞凋亡。最终造成cfDNA的释放。
（7）无菌发炎：没有细菌的条件下机体也会发炎：因为1）当细胞或是神经细胞收到刺激就会释放促炎因子。2）受伤流血时使用止血剂。3）细胞死亡。无菌发炎是一个机体自我保护的机制。它的目的是移除细胞残留物，可溶性的致伤物质，通过增加血流量和体液的释放以及招募巨噬细胞。发炎细胞所产生的物质还可以促进细胞分裂，和血液供应。NETs也会在发炎的过程中形成。
（8）锻炼：高强度的身体锻炼会导致白细胞的发炎反应，和oxidative stress。但是有研究报道说锻炼时产生的cfDNA是独立于白细胞氧化爆发，白细胞或者肌肉细胞凋亡的。说明不同形式的锻炼引发不同形式的cfDNA的释放。所以取血时候要注意患者的背景，不然会误判。
（9）癌症：癌症患者的cfDNA来源于癌症细胞和周围组织的细胞。细胞死亡是阻止癌细胞的，但是癌细胞会逃避这个过程。躲避死亡会增加cfDNA的含量。死亡也可能会促进癌症，可能是分泌MMP，生长因子，和细胞因子。



03、cfDNA的检测方法及目的

检测方法：
1、检测cfDNA片段大小

• 凝胶电泳，但是不能精确检测片段大小；
  
•   qPCR, 但只能检测事先选定的位点，并不适合基因组范围的分析；
  
• 电镜， 但费时费力，效率低；
  
• 大规模测序平台；
  

2、cfDNA相关的分子检测

• Windowed protection score（片段大小测量工具=在基因组里面一个特殊的点内跨越120bp的DNA片段数量-有端点的片段的数量）。它和核小体距离有相关性。我们可以根据核小体的距离来推测cfDNA的来源。
  
• 甲基化检测：plasma DNA tissue mapping
  

检测目的：
1、检测cfDNA的大小可以知道它是由哪种细胞死亡机制产生的：～10000bp的cfDNA由细胞坏死产生；140-200bp的cfDNA由细胞凋亡产生；313-798bp的为孕妇cfDNA；
2、检测 cfDNA相关分子信号，比如甲基化，以及核小体距离可以追溯它的组织来源；
3、检测特定序列的cfDNA的种类数量的变化可以判断癌症，以及相关疾病。

参考文献：

[1]Aucamp, Janine, et al. &#34;The diverse origins of circulating cell‐free DNA in the human body: a critical re‐evaluation of the literature.&#34; Biological Reviews 93.3 (2018): 1649-1683.
[2]Jiang, Peiyong, and YM Dennis Lo. &#34;The long and short of circulating cell-free DNA and the ins and outs of molecular diagnostics.&#34; Trends in Genetics 32.6 (2016): 360-371.

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/353155940