【PCR 梯度的进化】科研人必知

虎威将军

在不算太长久的分子生物学的发展史中，PCR技术的诞生犹如一把打开探索之门的钥匙，为整个分子生物学的发展提供了一个强大而可靠的工具。
在PCR诞生之初，PCR本身并不成熟，对于使用这一工具的科学家来说，可不是一件轻松的事情，首当其冲的问题是DNA聚合酶在高温失活的问题。这一问题在科学家发现了耐热的酶（如Taq）之后得到了解决。
与此同时，在实验过程中由于DNA序列的多样性，其最佳的反应条件也变得难以确定。因此在PCR发展的早期人们需要用一次又一次实验条件的组合来测定最佳的PCR反应条件，这个过程非常花时间与精力。这一情况直到上世纪90年代，一家叫Eppendorf 的公司发明了PCR梯度技术，才得以解决。有了梯度技术，PCR仪首次实现了在同一个模块上同时形成一系列温度分布的能力，也使得实验人员有了一次可以在PCR仪上去测试12种温度的办法，PCR实验从此进入了梯度时代。



Mastercycler gradient 采用PCR梯度技术可以一次测试12种温度，快速优化反应条件

后来相当长的时期，在PCR实验优化中摸索退火温度成为标准的预实验步骤，但是我们都知道PCR的实验一般有3个温度步骤来组成循环（点击了解PCR原理），那么除了退火温度以外，其他温度对PCR实验是否有影响呢？答案是肯定的，而这个答案对应的解决方法在梯度技术发明20多年以后，又由Eppendorf 的工程师们给出了解答。Eppendorf 在其Mastercycler® X50系列PCR仪上首次推出了2D梯度的概念。
2D梯度PCR是一种创新的分子生物学技术，旨在优化PCR反应条件，以提高扩增效率和特异性。传统的PCR技术通常在单一温度梯度下进行，而2D梯度PCR则在两个不同的温度梯度下同时进行。这种方法的主要优势在于它能够在一次实验中测试多个温度组合，从而快速找到最佳的反应条件。
技术原理

2D梯度PCR的核心在于同时在两个维度上设置温度梯度。 第一个维度通常是退火温度梯度，第二个维度则是变性温度梯度。通过在这两个维度上进行温度变化，可以在一个PCR反应板上同时进行多个反应条件的测试。这种方法不仅节省了时间，还提高了实验的效率和准确性。



2D梯度技术允许在一次反应中同时对退火和变性温度进行优化

应用领域

2D梯度PCR因其能较传统的梯度技术更加准确地找到最佳的温度组合，在多个领域中具有广泛的应用前景。它在基因克隆、突变检测、基因表达分析和基因组研究中表现出色。
技术优势

2D梯度PCR的主要优势在于其高效性和灵活性。通过一次实验即可获得多个反应条件的数据，大大减少了实验时间和成本。
详情请查看相关文献：
APPLICATION NOTE No. 423, Using the Mastercycler® X50 and Its 2D-Gradient to Increase Yield and Specificity of Your PCR


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