磁微粒化学发光工艺开发

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化学发光免疫分析(Chemiluminescence analysis,CLIA)诞生于1977年。根据放射免疫分析的基本原理，将高灵敏的化学发光技术与高特异性的免疫反应结合起来，建立了化学发光免疫分析法。
化学发光免疫分析法根据标记物的不同可分为三大类，即化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析法。
化学发光免疫分析是用化学发光剂直接标记抗体或抗原的一类免疫测定方法。目前常见的标记物主要为鲁米诺类和吖啶酯类化学发光剂；化学发光酶免疫分析(Chemiluminescent enzymeimmunoassay，CLEIA)属酶免疫分析，只是酶反应的底物是发光剂，操作步骤与酶免分析完全相同。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP )和碱性磷酸酶(ALP)；电化学发光免疫分析(Electrochemiluminescence，ECL)是指由电化学反应引起的化学发光过程。
化学发光免疫分析法是华美科赛格IVD原料验证的核心技术之一，主要双抗体夹心模式原理如下所示：


今天小编主要给大家分享磁珠包被和AP酶标记两方面的内容，希望对各位老师的研发工作有所帮助。
磁珠的包被流程
1. 磁珠选择：化学发光常用磁珠主要是粒径1-3um，根据免疫磁珠的基团不同，可选用氨基，羧基，Tosyl磁珠，SA磁珠等。
2. 磁珠的包被：
①羧基磁珠反应原理：羧基和EDC反应活化，形成中间体，中间体和抗体的氨基反应，将抗体连接在磁珠表面。
羧基磁珠的包被：分为一步法和两步法。一步法中，缓冲pH以及活化剂的用量对磁珠包被的效率影响很大，不合适都会出现磁珠的聚集，效率等。两步法中，羧基和氨基反应分为前后两个步骤，羧基活化在偏酸性条件下，效率更高。活化中间体和氨基的反应在偏碱性条件下效率更高。所以在羧基活化和抗体包被的步骤可以通过置换Buffer来调整pH值。大部分项目都可以用一步法，但并非所有项目都适用，包被过程用一步法还是两步法需要进一步进行对比试验，包被过程中活化剂EDC的用量，抗体的投料，各个Buffer的选择，pH，反应时间等条件都是需要调试优化的。
②Tosyl磁珠


在Tosyl磁珠和抗体结合的过程中，影响因素主要有硫酸铵用量，pH值，温度，反应时间和封闭过程等。在实际生产中，羧基磁珠使用过程工艺复杂，关键控制点多，包被过程中需要EDC的活化，活化情况的好坏会影响试剂的均一性。
Tosyl磁珠的特点则相反：用时长但工艺简单，生产易控制，使用中可以避免活化步骤对试剂性能的影响。但是Tosyl磁珠也有一些局限：①易产生非特异性吸附，影响本底。②反应条件相对苛刻，使用的抗体需要能在高温和碱性环境下长时间反应。所以在实际使用中可以根据抗体的特点来选择磁珠的官能团。
AP酶的标记
化学发光酶反应分析中常用标记酶为辣根过氧化物酶(HRP )和碱性磷酸酶(ALP)。辣根过氧化物酶华美科赛格主要用于板式化学发光，磁微粒化学发光采用的是AP系统。碱性磷酸酶(ALP)已广泛用于酶联免疫分析，他的发光体系是目前最重要、最灵敏的一类化学发光体系。这类体系中具有代表性的是ALP-AMPPD发光体系。在溶液中AMPPD的磷酸酯键很稳定，非酶催化的水解非常慢，而且ALP-AMPPD发光体系具有非常高的灵敏度，对标记物ALP的检测限达10-21 mol，是最灵敏的免疫测定方法之一。
酶结合物质量的好坏直接关系到免疫酶技术的成功与否，因此被称为是关键的试剂。
目前常用的酶结合物的合成方法主要有三种：
1. 戊二醛交联法：戊二醛是一宗双功能团试剂，它可以使酶与待结合物的氨基通过它而联结。合成方法分为一步法、两步法。
2. 过碘酸盐氧化法：本方法只适用于含糖量较高的酶，辣根过氧化物酶一般采用这种方式。
3. 琥珀酰亚胺-马来酰亚胺交联法：通过sulfo-SMCC异型双功能交联剂，将巯基与氨基结合，最终得到酶结合物。
案例分享---D-二聚体
D-二聚体(D-Dimer)，是交联纤维蛋白被纤溶系统降解产生的片段，其产生需要两个要素，即交联纤维蛋白的生成+纤溶酶的生成，DD升高提示凝血系统被激活同时有继发纤溶启动，DD可作为阴性排除肺栓塞（PE）和静脉血栓栓塞症（VTE）指标。
华美·科赛格D-二聚体(D-Dimer)单抗产品在磁微粒化学发光平台进行验证，得到良好反馈。CSB-DA220HmN③标记羧基磁珠，CSB-DA220HmN④标记AP，D-二聚体（D-Dimer）在研发初期我们三种方式都做过研究，第一种方法合成的酶结合物活性和效率都不高，影响免疫分析的灵敏度；第二种方法操作较为复杂，损失大，适合HRP的标记；最终选择sulfo-SMCC的合成方法，效率高，重复性好。



为验证抗体的临床相关性，将本公司的自产抗体配对CSB-DA220HmN③配CSB-DA220HmN④制成试剂检测40例希森美康赋值样本进行检测（浓度范围：0.21-34.9 ug/ml），两者相关性高达0.96，说明本公司自产单抗适用于发光磁微粒平台。






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