干货时间 | 样本不达标=数据白做？数字PCR常规检测送样要求解析

莺歌燕舞

数字PCR是一种先进的核酸分子检测技术，通过将包含样本的反应体系分割成多个微小的反应单元，并在每个反应单元中进行独立的PCR扩增，最终通过统计每个反应单元中核酸扩增情况，通过泊松分布计算，得到投入反应体系中核酸模板的绝对拷贝数的值。



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然而样本质量的优劣对最终结果有直接影响，如果分析前的标本质量没有保障，那么不论分析时的质量如何，都将得不到可靠的检测结果。在此我们对数字PCR实验中常见的样本要求做一个梳理，以便大家能更加顺利的完成实验。
目的

保证实验所需样本达到检测技术要求。
适用范围
适用于微滴式数字PCR平台。
常见样本要求

1、血液样本：
适用项目：基因表达检测、基因突变检测、病原检测。
1️⃣抽提RNA

• 用EDTA抗凝管抽取足量全血（一般至少3mL）；颠倒混匀抗凝管8-10次，充分混匀EDTA和全血，保证抗凝效果。
  
• 血液收集后最好保存在2-8℃。若mRNA完整性非常关键，血液样品在2-8℃放置时间不要超过2小时。
  
• 血液在冻藏/解冻过程中会引起细胞破裂，最好避免冻藏。
  

2️⃣抽提DNA

• 用EDTA抗凝管抽取足量全血（一般至少3mL）；颠倒混匀抗凝管8-10次，充分混匀EDTA和全血，保证抗凝效果。
  
• -80℃ 冰箱中保存（可保存3～5年在规定保存时间内DNA降解幅度逐渐加大）。
  
• 运输时需要准备质地较厚的泡沫盒与充足的颗粒状干冰且务必使采血管被干冰覆盖。
  

2、血浆/胸水样本：
适用项目：基因突变检测、拷贝数变异检测、基因表达检测、miRNA定量检测。

• 5-6mL全血/胸水样本于采集后2小时内进行离心分离血浆/上清，1600g，4℃离心10min，分离上层血浆/上清后，16000g，4℃离心10min，再次分离上层血浆。
  
• 血浆要求2-3ml，所分离的血浆/上清，若不能立即进行后续实验，首选-80℃冰箱冻存。若无-80℃冰箱，可选择-20℃保存，应尽可能缩短冻存时间，尽快进行后续检测。冻存时注意密封及标记完整，避免反复冻融。
  

3、福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）样本：
适用项目：基因突变、拷贝数变异DNA检测。

• 用干净刀片去除多余石蜡。把样品切成5-10μm薄片。
  
• FFPE样本厚度为5-10μm，建议样本年限2年以内。
  
• 样本量，手术标本4-6片/位点，穿刺样本8-10片/位点。
  

4、细胞样本：
适用项目：基因突变、拷贝数变异DNA检测。

• 收集约1-4x106细胞（60mm培养皿或T25培养瓶），转移到1.5ml离心管中；室温3000rpm离心5min，(贴壁细胞去胰酶)，保留沉淀；PBS轻轻吹打清洗一次；3000rpm离心5min，去上清。
  
• 放入-80℃冰箱中保存。
  
• 上述处理过的细胞需干冰运输，需要准备质地较厚的泡沫盒与充足的颗粒状干冰且务必使带有细胞的离心管被干冰覆盖。
  

5、DNA/cfDNA样本：
适用项目：基因位点突变、拷贝数变异检测。

• DNA总量，一般要求DNA达到10ng/反应。
  
• 浓度≥0.6ng/ul/反应，体积≥15ul/反应。
  

注：以一个反应最大上样体积8ul估算，人基因组0.6ng/ul的浓度约5ng上样总量，基本维持某基因总拷贝数在1000拷贝左右，从而能够满足大多数的项目要求。受限于基因组完整度、物种基因组大小、多倍体或单倍体等复杂情况，该浓度要求不能完全代表所有情况。
6、RNA样本：
适用项目：基因表达量检测、融合基因检测、AR-V7等的项目检测。

• 浓度：≧40ng/ul，体积≥15ul/反应。
  
• 样本提取产物纯度(A260/A280)，1.5~2.4。
  

7、质粒样本：
适用项目：质粒定量、基因突变检测。

• 浓度：质粒样本须清晰标示，并标明“次方”。
  
• 质粒样本稀释至6次方及以下浓度，送样体积根据实验需求送样。
  

注：数字PCR的理论定量上限是10万拷贝，故一般建议质粒浓度不超过6次方，但受限于生产、运输保存条件、引物的扩增效率等因素，估算拷贝数并不能完全评价实测情况，以实际检测情况为准。
样本信息及接收

样本应提前规划编号，简洁且清晰，以保障检测前核对和检测样本无误。
注：科研项目样本及特殊样本，根据实际情况沟通后送样。

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