降落PCR（touchdown PCR）

笑看风云

降落PCR(Touchdown PCR)的原理

降落PCR是通过对反应体系中退火温度进行优化来提高反应的特异性，其基本原理为：根据引物的Tm值，设置一系列从高到低的退火温度，开始选择的退火温度高于估计的Tm值（退火温度的起始温度高于计算的Tm 15度左右），每一个（或n个）循环降低1℃（或n℃）退火温度，随着循环的进行，退火温度逐渐降低至Tm值，最终低于Tm值达到一个较低的退火温度。最后以此退火温度进行10个左右的循环。



降落PCR原理

PCR反应中退火温度会对扩增结果产生影响，随着退火温度的升高，扩增特异性会变好，同时扩增效率会变低。退火温度过高会使PCR效率过低，退火温度过低则会使非特异性扩增过多。降落PCR一开始先用高温扩增，保证扩增的严谨性（在较高的退火温度下通常得到特异性扩增产物），待目的基因的丰度上升后，降低扩增的温度，提高扩增的效率。当退火温度降到非特异扩增发生的水平时，特异产物会有一个几何级数的起始优势，在剩余反应中非特异的位点由于丰度低无法和特异位点竞争，从而产生单一的占主导地位的扩增产物。
降落PCR的优点

通过在初始循环中使用高于计算的Tm的温度，降落PCR 有利于引物-模板互补性最高的扩增子的积累。在随后的循环中逐步过渡到较低的温度，经过前面的几轮扩增后，靶标扩增子的含量增高，其含量远高于任何非特异性产物或引物二聚体，从而保证在后面的循环中扩增出想要的片段。
降落PCR的特点：

• 低水平、高特异性的扩增在循环的早期开始，此时的退火温度高于“最合适”的退火温度；
  
• 当退火温度在目的产物的Tm值与假阳性产物的Tm值之间时，目的产物的竞争优势更加明显；
  
• 较低的退火温度能很有效地增加目的产物的产量，同时使非特异性的扩增降到最低，因为特异序列在较高退火温度时得到扩增，等退火温度降到较低时，已积累大量的特异产物，减少了特异性引物与非特异序列结合的机会。
  

降落PCR的优点是可以增加某些基因的特异性，如果常规PCR循环程序的基因扩增效果不佳，可采取热启动加降落PCR，在非特异性背景较高的情况下,这招的确有效,但不绝对。
但是如果能用普通PCR技术扩出来的话，尽量用普通的聚合酶链反应，虽然降落聚合酶链反应比较省事省力，但是，它在一个很宽的退火温度里扩增，非特异性的条带会比较多。
温度梯度PCR与降落PCR的区别

温度梯度PCR是指在退火温度不太明确时，为了找到最优退火温度，在一台PCR仪上同时做多管PCR，每一管放在仪器内不同列/行上，分别进行PCR(如50℃~60℃ 可以分6管，分别为50，52，54，56，58，60度)，最后看看哪个温度的效果最好。总之是用来进行退火温度优化的。而降落PCR是在同一个PCR管内进行，只是每个循环的温度不同(如每个循环降1度)。一般兼并引物用这种方法多些。
什么情况下需要做降落PCR

在出现非特异条带时可以考虑用降落PCR，在高的退火温度下做几个循环，这样扩出的产物特异性好，可以做为后续反应的模板，然后在温度较低的情况下，以扩出来的特异性好的产物做模板进行后续PCR，这样不但特异性好，而且产物也够多,可以出现很好的结果。还有就是在刚合成引物还未经鉴定效果的时候，可以用降落PCR。
降落PCR注意事项

由于降落PCR在较早的循环中需避免低Tm值配对，在降落PCR中最好应用热启动技术。
降落PCR虽然有一定的优势，但它并非万能，降落PCR只能做到“锦上添花”，即能看见主带，但是存在杂带，可以利用降落PCR进行优化，但是如果连主带也看不见，只有杂带，那么用了降落PCR也不会有很好的效果。
如果扩增后跑胶观察到许多产物带或高分子量成片产物，可采取以下措施：

• 提高降落PCR的最高退火温度和最低退火温度，使其范围上移；
  
• 减少最低退火温度条件的循环次数；
  
• 使各退火温度下的循环数增加一个，如三个循环降低1℃；
  
• 用嵌套式引物重新扩增第一次PCR产物的稀释物（巢式PCR）；
  
• 放弃此套引物，重新设计引物扩增；
  

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