流式细胞术—FAQ（一）

笑看风云

1.流式染色条件是什么？
一般推荐室温染色15分钟；或4℃染色30分钟。具体请参照抗体说明书。

2.Th检测为什么要使用刺激阻断剂？
正常情况下，外周血中仅有极少量的Th1、Th2，IFN-γ、IL-4含量极少，无法检测到，需要刺激剂（PMA/Ionomycin Mixture）将Th细胞刺激分泌细胞因子，细胞因子产生后会被分泌到细胞外，无法进行检测。加入阻断剂 （BFA/Monensin Mixture），将细胞因子阻断在细胞内。

3.人全血Th检测为什么要CD3/CD8反设门？
PMA的刺激会诱发细胞表面CD4分子被内吞，导致CD4+的细胞明显减少，影响检测结果，此时需要利用CD8-细胞代替CD4+细胞进行设门。

4.流式中同型对照有什么作用？
同型对照是一种与流式抗体保持相似特性但缺乏特异性靶标的抗体。流式检测中，同型对照抗体用于阴性对照实验，帮助我们对特异性信号与非特异性背景染色进行区分，排除干扰信号，确保检测结果的准确性。同型对照还可用于流式细胞仪检测通道电压等参数的调节优化，提高检测的效率和效果。

5.为什么有时候同型对照的表达会比抗体的表达高？
首先需要检查同型对照是否加错类型、剂量等。其次，因为有些标志在细胞的表面或者胞内表达不高，而跟其类似的抗原非常多，那么加入同型对照时，同型对照非特异性的结合会超过抗体的特异性，所以会造成这种现象。这个时候推荐使用其他阴性对照，如空白对照等。

6.表达荧光蛋白的细胞可以固定吗？
可以。用4%的多聚甲醛固定10min，迅速用PBS冲洗一次，再用PBS洗3次，每次5min。

7.流式染色缓冲液（staining buffer）的配方是什么？
一般是PBS或者PBS + 3% FBS（胎牛血清）。

8.流式染色缓冲液（staining buffer）的作用和用法？
洗涤细胞；作为抗体孵育的介质，有一定的消除非特异性结合的作用，可以降低检测的背景。

9.抗体染色的细胞不能立即检测该如何处理？
如果实验对细胞活性要求比较高，如凋亡实验，必须尽快检测；如果实验对细胞活性要求不高，可以使用含有4%多聚甲醛的PBS固定样本30分钟，固定后的细胞4℃过夜保存，次日检测。

10.流式抗体普遍有多个克隆号，我应该选择哪个呢？
如果没有特殊要求或者特定的克隆号，您可以任意选择一个克隆号的抗体，也可以参考自己查阅的文献实验中所使用的克隆号进行选择。

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