Western blotting实验完整流程

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1. 收集蛋白样品
1.1、单层贴壁细胞总蛋白的提取：
（1）倒掉细胞培养瓶中的培养液，尽量倒干净，可用移液枪轻轻吸走残余培养液，操作时间宜迅速
（2）每瓶细胞加3ml-4ml 4℃预冷的PBS。平放“十字”轻轻摇动1min洗涤，弃去洗涤液，重复三次。PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
（3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（苯甲基磺酰氟）（100mM），摇匀置于冰上，PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。
（4）每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要反复摇动。
（5）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作迅速），然后用移液枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中（全程宜在冰上操作）。
（6）将离心管于4℃下12000rpm离心5min（提前预冷离心机）。
（7）将离心后的上清液分装转移到0.5ml的离心管中放于－20℃冰箱保存。
以上步骤可简单概述为：收集细胞、裂解细胞、离心取上清、保存。
1.2、组织中总蛋白的提取：
（1）将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
（2）加400 μL单去污剂裂解液（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。
（3）数分钟后再研磨一会儿并置于冰上，要多次研磨使组织尽量碾碎。
（4）裂解30 min后，即用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min（离心机提前预冷），取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃冰箱保存。
1.3、加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：
由于受药物的影响，部分细胞会脱落下来，所以除按上述1操作外还应收集培养液中的细胞。培养液中细胞总蛋白按下列方法提取：
（1）将培养液转移至15ml离心管中，于2500rpm离心5min
（2）弃上清，加入4ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，2500rpm离心5min。弃上清后用PBS再次洗涤一次。
（3）用移液枪吸干上清后，加100μL裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹动以使细胞充分裂解。
（4）将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃ 12000rpm离心5min（离心机提前预冷），取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃冰箱保存。
二、蛋白含量的测定
（1）取足量的1.5ml离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1ml。室温放置30min后即可用于测蛋白。
（2 ）取一管考马斯亮蓝加0.15mol/LNaCl溶液100ml，混匀放置2分钟可做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样品。
（3 ）弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5mL），再用无菌水洗一次。
（4） 取一管考马斯亮蓝加95ml 0.15mol/L NaCl NaCl溶液和5ml待测蛋白样品，混匀后静置2min，倒入扣干的比色杯中按sample键测样品。
注：原液浓度太高时进行稀释，用裂解液稀释。
三、电泳
第一步：清洗玻璃板
第二步：配胶


（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧,然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（2）配分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。待胶面升到玻璃板3/4位置时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。
注：加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。
（3）当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。配浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
注：插梳子时要使梳子保持水平。
（4）用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。
第三步：上样
（1）测定好蛋白含量的蛋白上清液以最低蛋白浓度的样品为参照，将所有样品蛋白浓度调到一致，按照上样缓冲液说明书加入一定量的上样缓冲液，沸水浴或者加热到98℃-100℃处理5分钟使蛋白变性。放置冰上3min，离心15min，13000rpm，4℃。
（2）加足够的1*电泳缓冲液后开始准备上样（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板）。先上Marker(4ul-5ul)根据说明书选择量的大小（Marker的作用是显示不同分子量蛋白的位置），然后按顺序加样品到后续孔中，样品量一般10-15ul,不能超过20ul。
（3）盖好电泳仪盖子，连接电源，注意正负极不要接反了。
第四步：电泳
浓缩胶80V电压跑20分钟，可多跑几分钟；分离胶180V电压跑至底端。
第五步：停止电泳
纯水冲洗玻璃板，取胶，清洗切去浓缩胶，在Marker下方切角做标记，将胶泡在清水中。
四、转膜（跑胶时准备转膜用品,最主要赶气泡）
第一步：剪PVDF膜,并提前切个角，甲醇中泡2-3min。
第二步：将膜、海绵、滤纸一起泡入1*转膜液中，放4℃保存。
注：转膜液可回收。
第三步：将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。(一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。)在垫子上垫2层滤纸，一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。将胶盖于滤纸上，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜用镊子盖于胶上，并除气泡。在膜上盖2层滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，合起夹子。整个操作在1*转膜液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。
第四步：将夹子放入转膜槽槽中，黑对黑,对红。电转移时会产热，过热有可能造成蛋白质的降解，同时大量产热，会使凝胶膨胀，有可能在胶和膜之间产生空隙，引起转膜不均匀，所以在转膜槽中放入冰盒，在冰水混合物中进行转膜。
注：转膜条件是电流300mA或电压70V，2h；另一个约束条件就是电压必须控制在60-70V，调节电流。
第五步：转完后将膜放入装水的小盒中冲洗，倒水后，加5%的封闭液，摇床封闭1h。
五．抗体孵育,免疫反应
第一步：回收封闭液,加入一抗,摇床30min-1h，4℃过夜,再孵育30min-1h。
第二步：一抗回收，用PBST洗，洗5次，每次5min。（少时多次）
第三步：加二抗，孵育2h。
第四步：二抗回收，用PBST洗，洗5次，每次5min。（少时多次）
第五步：纯水冲洗5-7次，倒掉纯水，加化学发光，膜在化学发光中浸泡2-3min，成像。

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