WB中ECL常见问题解析与解决方案

生物科研实验室

了解过ECL的发光原理的同学都知道，即使严格按照流程操作，Western Blot仍可能出现各种"意外"，今天给大家分享ECL检测中常见问题及解决方案！

一、ECL发光原理回顾
ECL化学发光基于辣根过氧化物酶（HRP）催化鲁米诺（Luminol）与过氧化氢（H2O2）的氧化反应，产生425 nm波长的光子，通过X光胶片或CCD成像系统捕获信号。
A液：鲁米诺（发光底物）+ 发光增强剂

B液：过氧化氢（H2O2）+ 稳定剂

使用时需1:1混合A/B液，现配现用，避免交叉污染

二、ECL常见问题及解决方案

1. 灵敏度降低，曝光时间延长

可能原因：排除样本表达和操作的原因有可能是ECL失效/保存不当（B液易失效，保存需要注意不要冷冻）导至试剂灵敏度降低。

处理建议：更换新的ECL。
2.曝光背景高

可能原因：排除样本表达和操作的原因可能是不同品牌ECL检测灵敏度差异导至。高灵敏度ECL会放大非特异信号导至背景增高；低灵敏度ECL可能因为延长曝光时间导至高背景产生。

处理建议：增大/降低上样量/稀释倍数；增强洗涤
注：曝光时长一致，背景A＞B，是由于灵敏度A＞B导至
3.曝光条带反白 可能原因：①蛋白质上样量过高:当蛋白质上样量过高时，信号可能会过强，导至条带中间部分泛白。 ②一抗或二抗浓度过高:如果二抗浓度过高，HRP过多，底物迅速被消耗，机器可能无法检测到底物反应的光，因此显示白色。 ③曝光时间过长:曝光时间设置不当，如过长，会导至图像过曝，从而使条带中间部分呈现白色。 处理建议：调整蛋白质上样量；稀释一抗和二抗；合理调整曝光时间。
.信号迅速淬灭/条带信号不一致 可能原因：目标蛋白含量过高HRP或反应底物局部耗尽。 处理建议：确保抗体均匀孵育，工作液足量且充分覆盖膜表面。
掌握这些原理和技巧后，相信你的Western Blot实验将事半功倍！