培养基制备原则有哪些?

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培养基制备原则有哪些?
原文地址：https://www.zhihu.com/question/371095689

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方案摘要： 在化妆品微生物安全检测领域，金黄色葡萄球菌作为关键风险指标，其检测准确性依赖优质稳定的培养基。本方案引入了RAYPA培养基自动制备分装仪，革新传统人工制备流程。该仪器凭借智能化温度、压力控制及精准定量分装系统，实现培养基从原料溶解、灭菌到分装的全流程自动化操作，有效规避人工称量误差、灭菌不彻底、分装体积偏差等问题，保障培养基均一性与无菌状态。在化妆品金黄色葡萄球菌检测中，标准化的培养基制备与分装为后续样品增菌及鉴定奠定可靠基础，显著提升检测效率与结果可信度，同时降低操作人员劳动强度与生物安全风险。科学、规范，为化妆品质量安全监管提供高效稳定的技术支撑。


方案详情：
一、实验原理
化妆品金黄色葡萄球菌检测依据其生物学特性开展。利用选择性增菌培养基抑制杂菌，促进金黄色葡萄球菌生长，使其数量达到可检测水平。接着将增菌后的样品接种到鉴别培养基上，根据金黄色葡萄球菌产生的溶血环、菌落形态等特征进行初步识别，再通过革兰氏染色观察其典型的革兰氏阳性球菌形态。最后利用生化试验，确认是否为金黄色葡萄球菌，以此实现对化妆品中该菌的检测判定。
二、‌实验准备
1、设配和材料
① 显微镜。
② 恒温培养箱：36℃±1℃。
③ 离心机。
④ 灭菌刻度吸管，10mL、1mL。
⑤ 试管：18mmx150mm。
⑥ 载玻片。
⑦ 酒精灯。
⑧ 三角瓶，250mL。
⑨ 高压灭菌器。
⑩ 恒温水浴箱。
⑪ Pipetty电动移液器1ML、10ML量程。
⑫ RAYPA培养基自动制备分装仪。


2、试剂和材料
① SCDLP 液体培养基。
② 营养肉汤。
③ 7.5%的氯化钠肉汤。
④ Baird Parker 平板。
⑤ 血琼脂培养基。
⑥ 甘露醇发酵培养基。
⑦ 液体石蜡。
⑧ 兔（人）血浆制备。


三、实验步骤
1、培养基制备：使用RAYPA培养基自动制备分装仪，自动制备、灭菌及分装实验所需的培养基。


2、增菌：使用Pipetty电动移液器，设置混匀模式，将样品1：10稀释，然后取10mL接种到 90mL SCDLP 液体培养基中，置 36℃±1℃培养箱，培养 24h±2h。
注：如无此培养基也可用 7.5%氯化钠肉汤。
3、分离：自上述增菌培养液中，取1-2接种环，划线接种在 Baird Parker平板培养基，如无此培养基也可划线接种到血琼脂平板，置 36℃±1℃培养 48h。在血琼脂平板上菌落呈金黄色，圆形，不透明，表面光滑，周围有溶血圈。在Baird Parker 平板培养基上为圆形，光滑，凸起，湿润，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明带。用接种针接触菌落似有奶油树胶的软度。偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落，但无混浊带及透明带。挑取单个菌落分纯在血琼脂平板上，置36℃±1℃培养 24h±2h。
4、染色镜检：挑取分纯菌落，涂片，进行革兰氏染色，镜检。金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，排列成葡萄状，无芽胞，无荚膜，致病性葡萄球菌，菌体较小，直径约为 0.5μm-1μm。
5、甘露醇发酵试验：取上述分纯菌落接种到甘露醇发酵培养基中，在培养基液面上加入高度为 2mm-3mm 的灭菌液体石蜡，置 36℃±1℃培养 24h±2h，金黄色葡萄球菌应能发酵甘露醇产酸。
6、血浆凝固酶试验：使用5-1000量程的Pipetty电动移液器吸取1:4新鲜血浆0.5mL，置于灭菌小试管中，加入待检菌24h±2h肉汤培养物0.5mL。混匀，置36℃±1℃恒温箱或恒温水浴中，每半小时观察一次，6h之内如早现凝块即为阳性。同时以已知血浆凝固酶阳性和阴性菌株肉汤培养物及肉汤培养基各0.5mL，分别加入无菌1：4血浆0.5mL，自动混匀后，作为对照。


四、结果报告
凡在上述选择平板上有可疑菌落生长，经染色镜检，证明为革兰氏阳性葡萄球菌，并能发酵甘露醇产酸，血浆凝固酶试验阳性者，可报告被检样品检出金黄色葡萄球菌。

长长的路

                                                 培养基的质量控制

1.证明文件
  1.1生产企业提供的文件生产企业应提供下列材料：
  一一培养基、独立成分、添加剂的名称及产品编码；
  一一批号；
  一一培养基的最终pH；
  一一储藏信息和有效期；
  一一质控证书和所用的测试菌株；
  一一性能测试的结果与验收标准；
  一一技术数据清单；
  一一必要的安全/危害数据。

  1.2产品的交付验收
  对每一批产品（成分或培养基），均应检查：
  一一产品的标识；
  一一包装完整性；
  一一产品的有效期；
  一一支持性文件。
  记录产品的接收日期。




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2.贮存
  2.1总则
  应严格按照供应商提供的贮存条件、有效期和使用方法进行培养基的保存和使用。

  2.2脱水培养基及其添加剂的质量管理和质量控制
  新购买的培养基一般为脱水的粉状或颗粒状，保存在密闭的容器中。用于菌种选择或鉴定的添加成分通常为冻干物或液体。培养基的购买应有计划，以有利于存货的周转（即掌握先购先用的原则）。实验室应保存有效的培养基目录清单，清单应包括以下内容：
  一一容器密闭性检查；
  一一首次开封日期；
  一一内容物的感官评价。
  对于新开封的培养基，应对其质量进行检查。通过粉末的流动性、均匀性、结块情况和色泽变化等判断培养基质量的变化。若发现培养基受潮或物理形状发生明显改变则应废弃。

  2.3商品化即用型培养基
  应严格按照供应商提供的贮存条件、有效期和使用方法进行培养基的保存和使用。

  2.4实验室制备的培养基
  培养基的保质期各不相同。不同的标准中均有明确规定了保存的条件和保质期。培养基应保存在防止其成分发生变化的环境下，即应避光、干燥保存；如有必要，用保存于2℃～8℃冰箱中，或依据培养基要求的储存条件进行保存。除标准规定或保质期验证实验的结果表明有较长的保质期外，通常平板保存不超过2周～4周，三角瓶和试管的保存不超过3个月～6个月。除标准规定或保质期验证实验的结果表明有较长的保质期外，含有不稳定添加成分的培养基应即配即用。对发生化学反应或含有不稳定物质的固体培养基也应即配即用，不可二次融化。
  实验室应对贮存培养基的有效期进行规定。观察培养基颜色变化，是否有蒸发/脱水情况，是否有微生物生长。当培养基发生这类变化时，应停止使用。在使用和进一步加热前，应事先将培养基放置到室温。

3.培养基的实验室制备
  3.1总则
  正确制备培养基是微生物检验的最基础步骤之一。使用脱水培养基和其他成分，尤其是含有有毒物质（如胆盐或其他选择剂）的成分时，应遵守良好实验室规范和生产厂商提供的使用说明。培养基的不正确制备会导致培养基出现质量问题。
  使用商品化脱水合成培养基制备培养基时，应严格按照厂商提供的使用说明配置。记录所有相关数据，如质量/体积、pH、制备日期、灭菌条件和制备人员等。
  使用各别成分制备培养基时，应按照配方准确配制，记录所有细节信息，如：培养基名称和类型及试剂级别、每个成分物质含量、制造商、批号、pH、培养基体积（分装体积）、无菌措施（包括实施的方式、温度及时间）、配置日期、人员等，以便溯源。

  3.2水
  除特定要求，实验室用水的电导率在25℃下应不高于25μS/cm （相当于电阻率注0.4MΩcm)。
  微生物污染应不超过103CFU/mL，最好低于102CFU/mL。

  3.3称量和复水
  称量所需量的脱水培养基（注意防止吸入粉末，尤其是含有有害物质的培养基粉末），先加入少量水，充分混合（庄意避免培养基结块）后再加水至所需的量。

  3.4溶解和分装
  脱水培养基加水后适当加热，并不停搅拌使其快速溶解，必要时，重新溶解。含琼脂的培养基在加热溶解前应浸泡几分钟。

  3.5pH的测定和调整
  用pH计测定pH，必要时在灭菌前调节pH，除特殊说明外，培养基灭菌后冷却至25℃时，要求pH的变化不超过0.2pH单位。通常使用浓度约为40g/L（约1mol/L）的氢氧化钠溶液或浓度约为36.5g/L（约1mol/L）的盐酸溶液调节pH。如果灭菌后调节pH，溶液需灭菌。
  注：商品化培养基在高压灭菌前后pH可能发生明显变化，但使用蒸馏水或去离子水时，灭菌前无需调节pH。

  3.6分装
  将配置好的培养基分装到适当的容器中，容器的体积至少为培养基体积的1.2倍。

  3.7灭菌
   3.7.1概述
   培养基和试剂的灭菌通常采用湿热灭菌（3.7.2）或过滤灭菌（3.7.3）。
   有些培养基无需高压灭菌，可煮沸灭菌。如，含亮绿的肠道菌培养基对光和热特别敏感，应在煮沸后快速冷却，避光保存。同样，一些试剂则不需灭菌，直接使用（参见相关标准或生产厂商的使用说明）。
   3.7.2湿热灭菌
   湿热灭菌在高压锅或培养基制备器中进行。高压灭菌一般采用121℃±3℃灭菌15min。如果培养基的体积超过1000mL，要对灭菌条件进行适当的调整。所有操作均要按照标准和使用说明的规定进行。
   注：大容量培养基（＞1000mL）灭菌时可能会造成过度加热。
   加热后应采取适当的方式冷却，防止沸溢。这对大容量培养基和敏感性培养基（如含亮绿的培养基）是非常重要的。
   3.7.3过滤灾菌
   过滤灭菌可以在真空负压或正压条件下进行。使用无菌设备和0.2um孔径的滤膜。将过滤装置的各个部分消毒灭菌，或使用预消毒设备。
一些滤膜上附着蛋白质或其他物质（如抗生素）。为达到有效过滤，应事先将滤膜用无菌水润湿。
   3.7.4监测
   应对经湿热或过滤灭菌的培养基进行监测，尤其要对pH、色泽、灭菌效果和均匀度等指标进行监测。
  3.8添加剂的制备
  制备含有有毒物质（特别是抗生素）的添加成分时，应小心操作，避免因粉末的扩散造成实验人员过敏或发生其他不良反应。采用适当的预防措施并小心按照产品使用说明操作。不要使用过期的试剂；抗生素工作溶液现配现用；批量配置的抗生素溶液分装后可冷冻保存，但解冻后的贮存溶液不可再次冷冻；厂商应提供冷冻对抗生素活性影响的相关资料，也可由使用者自行测定。




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4.培养基的使用
  4.1琼脂培养基的融化
  将培养基放到沸水浴中或采用其他有相同效果的方法（如高压锅中的蒸汽）融化。经过高压灭菌的培养基尽量减少重新加热的时间，避免过度加热。培养基融化后立即移开，室温静置片刻（约2min)，以免玻璃容器发生破裂。
  融化后的培养基放人47℃～50℃恒温水浴锅中保温，冷却到47℃～50℃所需的时间取决于培养基的类型、体积和在水在锅里的分装量。融化后的培养基应尽快使用，放置时间一般不超过4h。剩余的培养基凝固后不得再次融化使用。特别是灵敏性培养基，应根据相关标准，缩短融化后放置的时间。
  将琼脂培养基倒人类似检测培养基使用的独立容器中，插入温度计，记录并保存琼脂的融化、温度。加入样品的培养基应将温度调节到44℃～47℃，或按照相关标准调节温度。

  4.2培养基的脱气
  必要时，在使用前将培养基放到沸水浴或蒸汽浴中加热15min，加热时松开容器盖子；加热后盖紧盖子，并迅速冷却至使用温度。

  4.3添加成分的加入
  对热不稳定的添加成分应在培养基冷却至47℃~50℃时加人。灭菌的添加成分加入前应冷却至室温，避免冷的液体会造成琼脂凝胶或形成片状物。将添加成分缓慢加入培养基并充分棍匀，尽快分装到待用的容器中。

  4.4平板的制备和储存
  倾注融化后的培养基到平皿中，使之在乎皿中形成一个至少3mm厚度的琼脂层（直径90mm的平皿通常要加入18mL～20mL琼脂培养基），或根据相关标准要求制备平皿。将平皿盖好皿盖后放置在水平平面使琼脂冷却凝固。如果平板要储存、培养时间超过48h或培养温度超过40℃，要增加培养基的倾注量。
  注：在培养过程中，琼脂培养基会损失水分，在某些环挠条件下会影响微生物的生长。造成培养基水分损失的因素很多，如培养基的成分、平皿中培养基的量、培养箱的类型（如使用带凤扇的培养箱）、培养箱里的空气湿度、平皿在培养箱中放置的位置和数量以及培养温度等。
  凝固后的培养基应立即使用或存放在防止其成分发生变化的条件下，如存放于暗处和（或）5℃±3℃冰箱的密封袋中（见4.2）。在平板的底部或侧面做好标记，标记的内容包括培养基名称、制备日期和（或）有效期。也可使用适宜的培养基编码系统进行标记。
  将倾注好的平板放在密封袋中冷藏可延长储存期限。为了避免冷凝水的产生，平板应冷却后再装人密封袋中。贮存前不要对培养基表面进行干燥处理。
  对于采用表面接种的固体培养基，应先对琼脂表面进行干燥：揭开平皿盖，将平板倒扣于烘箱／培养箱中（温度设置为25℃～50℃）；或放在有对流风的无菌净化台中，直到培养基表面的水滴消失为止。注意不要过度干燥。商业化的平板琼脂培养基应按照厂商提供的说明使用。

  4.5培养基的弃置
  所有污染和未使用的培养基的弃置应采用安全的方式，并符合相关法律法规的规定。

5.最终培养基的性能测试
  5.1概述
  最低标准参见5.2和5.3；实际上，食物和水中可能含有应激微生物。培养基对应激微生物复苏的反应的适应性应考虑在内。

  5.2物理质量控制
  见下一篇。

  5.3微生物质量控制
   5.3.1污染的控制
   从每批制备好的培养基中选取适量进行污染测试。
   5.3.2测试菌株
   测试菌株是具有其代表种的稳定特性并能有效证明实验室特定培养基最佳性能的一套菌株。测试菌株主要购置于标准菌株保藏中心，也可是实验室自己分离的具有良好特性的菌株。实验室应检测和记录标准储备菌株的菌株特性，新复苏的菌株可能会有非特异性反应，使用时应引起注意；最好使用从食物或水中分离得到的菌株。
   每种培养基的测试菌株应包括：
   一一具有典型反应特性的强阳性菌株；
   一一弱阳性菌株（如对培养基中选择剂等试剂敏感性强的菌株）；
   一一显示阴性特性的菌株；
   一一部分或完全抑制菌株。
   5.3.3即用型培养基和试剂
   商业化即用型培养基的生产商如果通过ISO9000体系认证，应在适当位置有质量声明并提供培养基的品质证书。这样，使用者无需进行大量的培养基测试工作，但应确保贮存条件与厂商推荐的一致。即用型培养基至少要求进行定性测试。
   5.3.4商品化脱水合成培养基制备的培养基
   对分离和计数培养基而言，至少应进行半定量测试。对于鉴别培养基而言，只需进行定性测试。定量测试对培养基的质量有更高的保证。
   不含指示剂和选择剂的培养基，只需用阳性测试菌株进行检测。含有指示剂和选择剂的培养基，应使用能证明其指示和选择功能的菌株进行检测。复合培养基（即加入添加成分的培养基）应用具有5.3.2列举的特性的菌株逐批进行验证。
   5.3.5各别成分制备的培养基
   建议除了按照5.3.4中进行定性测试外，还应进行定量测试以监控基础材料的质量，培养基的生长率和实验室内部的配制规范。




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培养基的质量保证一一疑难解答

异常现象	可能原因
培养基不能凝固	培养基制备过程中过度加热pH值造成培养基酸解琼脂使用量不正确琼脂未完全溶解培养基成分未充分混匀
pH值不正确	培养基制备过程中过度加热水质不佳外部化学物质污染在不正确温度下测量pH值pH计未正确校准脱水培养基质量差
颜色异常	培养基制备过程中过度加热水质不佳脱水培养基质量差pH值不正确外来污染
产生沉淀	培养基制备过程中过度加热水质不佳脱水培养基质量差pH未正确控制如果是各别成分制备的培养基一一原材料不纯
培养基出现抑制/生长率低	培养基制备过程中过度加热脱水培养基质量差水质不佳配方使用不对，如，培养基成分称量不准确，添加物浓度不正确容器或水中含有害残留物
选择性差	培养基制备过程中过度加热脱水培养基质量差配方使用不对添加成分不正确，如加入添加成分时培养基过热或添加浓度错误添加物被污染
污染	灭菌不充分无菌操作有误添加物被污染