请问各位大佬，PCR实验有部分没跑出来是什么原因呢？

会里很

这个实验是用PCR鉴定不用的肌肉组织，属于是非常基础的实验了。本实验中使用的组织、taq酶、引物都是实验中心老师提供的，按道理来说应当出现两个条带，一个是猪一个是牛，不出现条带的是兔，但是我的结果中只有一个条带
我比较确定我的体系完全是按照实验指导来配的，那究竟是什么原因导致我有一组条带没跑出来呢？
因为我还是本科生，这个实验只做一次，没法进行重复实验验证，希望大家能给我一点建议，孩子要交实验报告



原文地址：https://www.zhihu.com/question/1905743966869127305

卡卡

PCR是很基础的实验，也是很复杂的实验。没有人能够仅凭一张结果图来帮找出你未获得预期结果的原因，甚至你连预期结果都没有给给出准确的描述，这就更让人无所适从了。
不过你的结果里面至少有一条明显的条带，那么至少证明PCR酶和显影过程问题不大，问题可能出在DNA样品制备、PCR引物设计、加样过程、产物长度等环节。鉴于题主是本科生，实验可能做的少，手好比较生，加样环节不一定稳定，建议可以多试几次。

同花顺

第一 引物对是不是已经落伍了，一般检测这种动物源性的PCR 都是选择的很保守的基因 但也不妨碍引物结合的序列是否发生突变
第二 样本处理是否正确，这一点关系到你的检测初始模版量，或者说你的DNA有没有提取到
第三 检测反应体系 但是由于你只跑一次 这点上没法比较
第四 marker确实有点暗了 但目标条带亮度还行 这点应该没啥问题

继续前进

本人生信人最近转湿实验，每天都死在非常基础的实验上，很能理解题主的忧伤和无助，浅答一下。
古人云，实验里最关键的步骤，尤其是决定能否成功的步骤，往往都没有写在protocol里。就算是所有人用着一模一样的protocol，诶，你猜怎么着，就是有人次次能成有人死活做不出来~
那么我们看看PCR基本有哪些步骤，以及可能存在哪些问题（我这几次都死在了哪里）：
我们倒着看，一步步溯源
1. 跑胶

其实能看出题主不亮的部分似乎是有一些浅浅的条带的。这个地方最关键的是marker能亮，就问题不大。因为完全存在，懒得配所以使用了实验室里来源可疑的胶遂失败/染料出问题/点胶技术太差直接相忘于江湖/灯出问题或者不会操作仪器照相没照对/电压不对片段跑飞/接反了嘿嘿嘿跑飞…………等等……但是如果marker作为基准，它在的话，说明至少胶这一步问题不大，问题出现在前面。
2.跑PCR

跑PCR基本都是仪器自动的，这一步也很难出现问题。存在选错程序之类的，需要一步步确认仪器保存的程序里复核循环数、退火温度、时间。
3.加样

加样最常见的问题就是忘记加东西了（没错但是真的很容易发生），以及加完都要好好混合。各种样本里Mg²⁺、dNTP 失效或浓度偏低，这些消耗品可能就存在问题。但是这个过程中最娇弱的是Taq酶，一定要最后最后加！！拿出来之后也要放在冰上，要加入有其他缓冲物等等的体系里（也要冰冰的），用完立刻放回-20℃冰箱。加完之后也尽快上机。这一步也要记得把样本和Master Mix混合好，尤其是pcr管小小的，很容易就挂壁嘞。
当然也存在一个问题就是无DNA的样本被莫名其妙的基因污染，那么在跑胶的时候就会看到只加了水那一栏出现了蜜汁条带……
引物序列及设计之类的不讨论，默认没错，应该蛮重要的，但是太高级了，不是我等能探讨的问题。
4. 提取DNA

如果以上确认都没有问题（重复PCR之后还是没条带），那么可能是提取DNA就出现了问题。再往上也可能是取样的过程就有问题，乃至样本就目标物很低（比如我自己养菌，可能存在它本身就没怎么繁殖，浓度整体很低。亦或者说放久了也不行，DNA不需要非常新鲜的样本，但是根据样本类型也不能放太久）。
内容比较口语，具体建议好好看书。但是不管是实验，亦或者是debug，还是整体的科研，做不出来是常态。这个实验的目的也不是让你真的去提取什么，更多是去练习这个操作（哈哈哈我感觉我第三次之后基本就该成功的都成功了），以及在实验报告的反思里训练怎么寻找问题和下次优化的能力。综上，基本思路是拆解每一个步骤，然后试图寻找可能的问题所在并优化，以及是不是需要在之前就对实验流程很了解，在善良美丽的师姐带你做实验的时候能最高效吸收她每一个步骤中的细节，适时提问确认她可能都无意识在操作的细节，又或者说是理解背后的原理，知道哪些部分最关键，以及如果出现问题该调整哪些方面……等等……
以上抛砖引玉，帮助自己记录学习，共勉！

继续前进

首先不知道是你曝光没调好，还是上样量有问题，marker都是黯淡不清的。
其次明显看到别的孔也有长短不一的条带，应该是非特异性扩增，说明这引物设计得也不咋地。

卡卡

不知道，就算给你空降一个诺贝尔奖的大佬导师也不会知道。反而是你的实验课老师/助教/同学还更有可能知道发生了什么。