透氧热塑性塑料聚甲基戊烯在长期芯片细胞培养和芯片有机器件中的应用（上）

微流控芯片

通过实验和分析，研究了透气性热塑性材料聚甲基戊烯（PMP）在芯片有机物（OoC）和长期芯片细胞培养应用中的适用性。我们使用装有氧传感器的密封培养室装置，测试并比较了PMP与常用的玻璃和聚二甲基硅氧烷（PDMS）。我们发现，与玻璃对照组相比，PMP和PDMS在4天的上皮（A549）细胞培养过程中具有相当的供氧性能，氧气浓度稳定在16%，而玻璃对照组的氧气浓度降至3%。首次获得了生长在PMP上的细胞的透射光图像，证明PMP的光学特性适用于非荧光活细胞成像。在结合透射光成像和钙黄绿素AM染色后，A549细胞的细胞粘附、增殖、形态和存活率在PMP和涂有聚-L-赖氨酸的玻璃上显示相似。与PDMS相比，我们证明了薄至0.125mm的PMP薄膜因其优异的光学性能和机械刚度而与高分辨率共聚焦显微镜兼容。PMP还被发现与设备灭菌、细胞固定、细胞通透性和荧光染色完全兼容。我们设想这种材料可以扩展目前最先进的微流体应用范围，因为它具有有益的物理特性和适用于不同方法的原型制作。这项工作中展示的集成设备和测量方法可以转移到其他基于细胞的研究和生命科学应用中。

1.导言

片上组织（OoC）是一个快速发展的研究领域，有可能在体外复制人体生理学的关键方面，从而成为精准医学、药物筛选以及器官功能和疾病病理生理学研究的创新平台。人们对新型材料和技术的兴趣和需求日益增长，这些材料和技术可以在OoC和芯片实验室平台中保留天然细胞环境，用于长期细胞培养研究。根据应用需要不同的材料性能组合，这反映在最近报道的用于制造OoC器件的各种不同材料中。这包括弹性体（如聚二甲基硅氧烷（PDMS）、SU-8聚合物、聚酯弹性体和热塑性弹性体）、热塑性塑料（如聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、聚碳酸酯（PC）、环烯烃共聚物（COC）、聚苯乙烯（PS））、天然聚合物（如胶原蛋白、纤维蛋白、藻酸盐和透明质酸）、混合材料（如PEG纤维蛋白原和PLA壳聚糖明胶）、粘合剂和环氧树脂和非化学计量硫烯环氧树脂（ostemer））、3D打印树脂（如紫外线固化树脂、牙科树脂和水凝胶）和无机材料（如玻璃、硅和陶瓷））。通过整合多种材料和传感方法，已经投入了许多努力来扩展平台的功能。然而，由于各种材料限制，这些平台通常仍会影响细胞实验，并可能禁止不同实验室之间直接比较结果。在这项工作中，我们展示了热塑性材料聚甲基戊烯（PMP）在长期片上细胞培养中的新应用，将其与玻璃和PDMS（片上细胞研究中常用的两种材料）进行了比较，并为细胞培养设备中的氧气供应和氧气监测集成提供了理论和实验见解。

1.1.培养细胞的气体和营养供应

在常规细胞培养和在OoC设备内的密闭空间中培养细胞时，持续获得必要的营养物质和气体是培养细胞的必要条件。在传统的细胞培养中，定期更换培养基以输送营养并去除细胞产生的废物。同时，分泌的可溶性因子也被去除。气体供应是通过从周围空气通过细胞培养基扩散来提供的，因此是连续的。所有细胞都需要持续的氧气供应，在用碳酸氢盐缓冲液配制的培养基中培养的细胞也需要周围空气中5%的二氧化碳，以产生7.0-7.4的生理pH值。缺乏适当的氧气供应会通过激活缺氧诱导因子（HIF）家族的蛋白质对实验结果产生重大影响，HIF家族可以在低氧条件下重写细胞转录程序。特别是，HIF-1在调节多种细胞过程中起着重要作用，如增殖、凋亡、葡萄糖代谢、蛋白水解等。 .HIF-1目前因其在肿瘤低氧微环境中的细胞存活中的作用而引起了许多研究人员的关注。

1.2.微流体细胞培养装置中气体供应的解耦

对于用玻璃等不透气材料和PMMA、PC、COC和PS等常见热塑性塑料制成的OoC和细胞培养装置，培养基的灌注是营养物质和气体的唯一供应来源，也是去除废物和分泌的可溶性因子的唯一来源。然而，介质灌注也会对细胞施加显著的流体剪切应力，导至不希望的细胞类型特异性和剪切应力水平特异性反应。除非正在研究剪切应力本身的影响，否则将灌注流速以及剪切应力保持在尽可能低的水平是有益的。Bunge等人比较了细胞消耗或产生的重要化合物（葡萄糖、乳酸、铵和氧气），发现氧气的交换频率是其他化合物的10倍。因此，气体供应与介质灌注分离的设备非常有益。此外，从实验目的本身的角度来看，持续的培养基交换也可能是非常不理想的，因为它还会从细胞附近去除正在研究的未结合化合物（例如细胞因子）。在处理非贴壁细胞、细菌或病毒时，灌注流量也可能存在问题。

1.3.PDMS材料在细胞培养和Ooc设备中的应用

气体供应的解耦是透气弹性体材料PDMS如此常用于制造用于细胞培养的微流体装置的主要原因之一。Bunge等人比较了用于哺乳动物细胞长期培养的微流控装置，在列出的18个装置中，有13个装置的气体是通过PDMS扩散供应的。其他装置依赖于用溶解气体灌注介质，通过水凝胶或开放式储器扩散。Wu等人回顾了用于体外控制气体微环境的微流体细胞培养装置，发现在列出的36个装置中，有34个至少部分是在PDMS中制造的。

PDMS作为一种研究工具具有一些有利的特性，因为它允许快速廉价的原型制作，易于与玻璃粘合，以及有利的光学特性和可变形性，允许集成片上泵和阀。然而，由于其多孔性和疏水性，它也会吸收小的疏水分子，这会影响疏水性药物和激素等重要溶质的浓度。其高透水性导至水从PDMS微流体回路中蒸发，并可能导至气泡形成和渗透压变化。PDMS的其他特性代表了基于细胞的研究的挑战，包括未交联低聚物的浸出，血浆亲水化后的疏水性恢复，这限制了保质期，以及高柔量导至微通道变形。此外，很明显，基于PDMS的设备的大规模生产和商业化受到了扩大规模困难和低制造吞吐量的阻碍。因此，需要确定用于制造透气OoC器件的新材料。

1.4.用于长期细胞培养研究的PMP材料

作为体外膜肺氧合系统中使用的一种气体可渗透的热塑性材料，材料PMP可能是一种很有前途的替代品，能够在用于长期细胞研究的设备中控制氧气。PMP，也称为TPXTM（透明聚合物X），是Mitsui Chemicals，股份有限公司的商标，是一种具有特征分子结构的4-甲基戊烯-1-基烯烃共聚物。分子的低堆积密度导至非常高的气体渗透性，使PMP与其他几乎不透气的热塑性塑料截然不同。然而，迄今为止，PMP在用于细胞培养和OoC的微流体装置中几乎没有得到探索。

Knoepp等人创建了一个基于PMP的微流体系统，用于同时进行拉曼光谱、膜片钳电生理学和活细胞成像，以研究单细胞对急性缺氧反应的关键细胞事件。该装置在PMP中研磨，并附着在具有较低玻璃底部的商业细胞培养皿上。在这项工作中选择PMP是有益的，因为它对目标生物标志物的拉曼光谱几乎没有干扰。Ochs等人开发了一种计算模型，用于预测已知透氧性的微流体装置和具有已知吸氧行为的细胞类型中的氧气水平。该模型是使用微流体结构通过实验确定的，这些微流体结构要么是在COC或PMP中注塑成型的，要么是在PDMS中成型的，这些结构附着在商业氧传感器箔上。当贴壁细胞在传感器箔上生长时，监测设备内的氧气水平两个小时。尽管这些研究显示了有希望的结果，但关于PMP在长期细胞培养设备中的使用，还有很多研究要做，例如在细胞培养的几天内进行氧气监测，以及在设备内PMP材料本身上培养和成像贴壁细胞。在Knoepp等人和Ochs等人[23]的先前工作中，装置的细胞粘附部分是由其他材料制成的。

在这里，我们对用于长期芯片细胞培养和OoC应用的设备的PMP材料的性能进行了研究。评估包括与玻璃相比的细胞粘附、增殖和形态的调查，细胞透射光和荧光共聚焦显微镜的适用性，与常见化学物质的相容性，设备制造以及在没有灌注的情况下在密封设备中培养4天的细胞供氧气体渗透性。为了评估PMP在这种环境下的透气性能，我们开发了一种带有隔离、封闭培养室的设备，该培养室装有氧气传感器，可以直接比较PMP和对照材料玻璃和PDMS（图1）。封闭的、氧气监测的培养室充当模块，通过将培养室、合适的微流体通道网络和芯片到世界的接口组合在一个单一的设计中，可以用作形成复杂的OoC甚至具有受控氧气环境的片上身体设备的构建块。

原型制作方法（即铣削）和适用于大规模制造的技术，如注塑都适用于PMP。这对于这种材料在医学和制药研究以及商业应用中的可重复性来说是一个很大的优势。这项工作的目的是证明PMP在长期微流体细胞培养设备中的潜力，并为对热塑性塑料基透氧细胞培养设备感兴趣的学术和工业界提供一种替代方案。

2.材料和方法

2.1.细胞和培养条件

A549细胞最初购自美国典型培养物保藏中心。它们在添加了10%胎牛血清和青霉素/链霉素抗生素溶液的F12K培养基中培养。细胞在标准条件下（37°C，5%CO2）在ThermoFisher系列8000 WJ培养箱中培养，达到90%融合后每2-3天传代一次。

2.2.培养箱装置的设计与制作

2.2.1.集成氧传感器培养箱装置的设计

培养室的设计是为了测试PMP的适用性，而不会因不必要的设计复杂性而影响实验结果。图2所示的设备用于氧气测量（第2.3节）和Hif1α染色。每个装置由一个容纳细胞培养室的基板（图2中从顶部起的第二层）和一个盖子（顶层）组成，两者都在PC中研磨。每个基板都有两个腔室，用于实验中的技术复制。设计了三种不同的设备变体，在基板下方集成了不同的材料，以获得PMP实验的充分控制：（1）带有PMP薄膜的设备（“传感器/PMP”）（图2a）；（2）带玻璃盖玻片的装置（“传感器/玻璃”）（图2b）；以及（3）带有PDMS薄膜的设备（“传感器/PDMS”）（图2c）。腔室直径为6.4 mm，与常规96孔板中的孔直径相似，高度为4 mm。盖子的设计符合基板的轮廓，一个圆形腔体（内径10 mm，外径13.6 mm，深度1.2 mm）用于插入10×1.5 mm2的硅胶O型圈（Otto Olsen，Skedsmokorset，Norway），确保了用螺钉固定时基板和盖子之间的紧密密封。使用硅胶Dowsil SG2 734将直径为3 mm的氧敏感点SP-PSt3-NAU-D3-YOP粘到盖子上，将其定位在组装好的装置中腔室的顶部中心。位于氧传感器点上方1毫米处的圆形插座设计用于容纳光纤，以读取敏感点的信号。对于PDMS，除了PSA外，还使用了在PC中铣削的支撑夹板，如图2c所示。PSA和PDMS之间的粘合强度不够，因此需要额外的机械夹紧。

2.2.2.无氧传感器培养箱装置的设计

为了比较PMP膜和玻璃盖玻片上的细胞粘附、增殖和存活率，使用了图3所示的装置。与第2.2.1节所述装置的唯一区别是盖子，盖子在这里仅作为支撑盖，以确保无菌。这些设备将被称为“非传感器/PMP”和“非传感器/玻璃”。

2.2.3.制造

使用三轴铣床在聚碳酸酯（Lexan）中铣削基板、盖子和夹板。用异丙醇擦拭研磨后的零件，在去离子水中漂洗，并在去离子水中超声处理5分钟。然后将氧敏感点粘在盖子上，在室温下干燥24小时。然后，在空气中对18个传感器进行了表征，发现平均氧浓度为21.5%，标准偏差为0.03%。厚度为0.125mm、等级为DX845的商用PMP薄膜ME31110通过首先用粒径为3µM、然后为1µM的金刚石抛光剂、DP悬浮液抛光，使其光学透明，并在去离子水中超声冲洗。使用PSA将玻璃盖玻片或PMP膜附着在基板上，使用PSA和夹板将PDMS膜附着在基板。

2.2.4.不同灭菌方法的兼容性测试

PMP薄膜暴露于以下灭菌化学品：Aerodesin 2000、70%乙醇和100%甲醇。对于物理灭菌，PMP薄膜在121°C的高压釜中暴露于蒸汽灭菌20分钟，在层流柜中暴露于紫外线30分钟或等离子体处理。使用配备有13.56 MHz/50 W发生器的低压等离子体清洁器进行等离子体处理，步骤如下：（1）将工作室中的空气抽空，并将压力降至0.1毫巴，（2）向工作室供应氧气（5分钟，流量10sccm），以及（3）运行等离子体处理过程（50 W，5分钟），保持氧气流量为10sccm。

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