脑胶质瘤微流控芯片模型的构建及中药半枝莲药效评价应用研究（下）

微流控芯片

3.1脑胶质瘤芯片模型内的细胞生长情况

通过分析U251芯片模型中培养的细胞的表型和活力，评估该模型内脑胶质细胞瘤细胞的活性。在不改变培养条件的情况下，以1×107个/ml细胞密度接种构建芯片模型，培养48 h后进行活力和表型分析。图2A为明场下细胞形态，图2B为模型内的细胞形态，U251细胞在芯片内呈不规则的3D结构生长。图2C为培养48 h后U251细胞活/死评估的荧光图像，绝大多数为呈现绿色荧光的活细胞，表明模型内大部分细胞存活。与0 h芯片内U251细胞活力相比，U251细胞在芯片中培养48 h后仍显示出较高的活力水平（>91%），说明细胞在芯片内培养48 h后生长状态良好，可以用于后续的药效评价研究（图2D）。

3.2肿瘤微环境表征结果

在肿瘤细胞高速生长与增殖的过程中，往往会伴随缺氧环境的形成。为确定芯片模型中U251细胞是否处于低氧环境，通过免疫荧光染色，对2D培养和3D培养模型中的U251细胞进行HIF-1α的表征。如图3所示，在3D培养的芯片模型中，缺氧状态标记物HIF-1α的荧光强度高于2D细胞培养模型，说明在3D培养条件形成的立体环境中，部分区域细胞处于相对缺氧状态，可能产生更强的缺氧反应；而在2D培养条件下，细胞间相互作用和信号传导较为简单，氧气分布比较均匀，细胞的缺氧反应相对较弱。

3.3模型内阳性药活性评价结果

为了评估该芯片模型在研究药物抗脑胶质瘤活性的适用性，分别考察了两种抗脑胶质瘤阳性药物，即TMZ和DOC，在2D培养和3D培养条件下对细胞活力的影响，结果如图4所示。阳性药TMZ和DOC对U251细胞具有一定程度的杀伤作用，随着浓度的升高，细胞存活率逐渐降低；与2D培养相比，3D培养芯片模型内的U251细胞在暴露于不同浓度TMZ（100、200、300、400 µmol/L）和DOC（2.5、5、10、20 μmol/L）的细胞活力均较高，其中，200 μmol/L和400 μmol/L的TMZ组（图4A）和20 μmol/L的DOC组（图4B）细胞活力均显著高于相应的2D培养组（P<0.05）。表明在相同浓度条件下，3D条件培养的芯片内缺氧微环境或细胞外基质能为细胞生长提供更稳定的条件，促进肿瘤细胞生长，从而表现出模型内细胞活力更高。

3.4 阳性药对模型内细胞凋亡的影响

通过JC-1荧光探针监测细胞线粒体膜电位，评估芯片模型内细胞凋亡情况，以细胞活力更高的3D培养芯片模型作为研究平台，并选择阳性药TMZ和DOC评价该芯片模型用于研究药物抗脑胶质瘤活性的可行性，结果如图5所示。通常在健康细胞的线粒体内，JC-1以高膜电位的红色荧光聚集体形态存在；在不健康或发生凋亡的细胞线粒体中，JC-1则以绿色荧光的单体形式呈现。分别使用TMZ和DOC处理后，3D芯片模型内U251细胞的红/绿荧光强度比率随着药物浓度的增加而降低，说明细胞内线粒体膜电位随着阳性药浓度的升高而下降，其中，400 μmol/L的TMZ组（图5A）、10 μmol/L和20 μmol/L的DOC组（图5B）与对照组相比，对U251细胞凋亡的影响有显著性差异，说明这两种阳性药均可通过诱导细胞凋亡杀伤U251细胞。以上结果表明本研究所构建的U251细胞微流控芯片模型具有评价药物抗肿瘤药效的能力，可以应用于胶质瘤细胞的毒性评价和凋亡评价，为后续应用于中药抗脑胶质瘤药效评价奠定基础。

3.5半枝莲提取液抗脑胶质瘤药效评价

3.5.1对U251细胞的毒性实验结果

采用CCK-8法考察不同浓度的半枝莲提取液对U251细胞的毒性，确定适宜的给药浓度。结果如图6所示，在0.5～8 mg/ml的浓度范围内，U251细胞的存活率随着半枝莲提取液浓度的增加而降低。为确保所选药物浓度能够有效杀伤U251细胞，同时避免浓度过高导至的非特异性毒性，本研究选择2 mg/ml的半枝莲提取液进行后续实验。

3.5.2基于U251芯片模型的半枝莲提取液抗脑胶质瘤药效评价

在所建立的U251芯片模型上考察半枝莲提取液对U251细胞的杀伤作用，通过活/死细胞染色和凋亡实验评价半枝莲提取液的药效，结果如图7所示。2 mg/ml的半枝莲提取液能在一定程度上降低细胞活力，与2D培养（平均细胞活力为64.82%）相比，3D培养的芯片上细胞活力更高（平均细胞活力为90.52%），提示在3D培养条件下可能需要更大剂量的半枝莲提取液才能对脑胶质瘤细胞产生杀伤效果。此外，凋亡实验结果显示，2D培养条件下有更多的细胞出现了线粒体膜电位降低的情况，而3D培养条件下呈绿色荧光的JC-1单体较少，说明3D培养的细胞发生凋亡的较少。综上表明半枝莲提取液在一定程度上可以杀伤U251细胞，诱导细胞凋亡，同时提示基于传统2D培养模型的药物筛选或药效评价结果与更接近体内肿瘤微环境的3D培养系统之间存在一定差距。

4.讨论

神经胶质瘤的侵袭性和肿瘤细胞对化疗药物的耐受性使治疗面临重大的挑战。尽管医学科学研究取得了重大进步，但神经胶质瘤的预后仍然较差，手术、放疗和化疗等传统治疗方法效果不佳。目前，体外研究采用的细胞模型仅提供微观层面的信息，无法模拟脑和脑肿瘤的解剖、功能和微环境状况。因此，近年来的研究专注于开发更先进的细胞培养模型，能够更好地模拟肿瘤细胞与复杂微环境之间的相互作用，以肿瘤球体、类器官、3D打印和微流控芯片模型等为代表的3D培养方式可构建较为理想的模拟肿瘤微环境的模型，为肿瘤细胞的增殖提供了合适的环境，并可作为体内肿瘤诱导的载体，从而可以研究肿瘤生长、侵袭以及与免疫系统的相互作用。

肿瘤微环境的细胞和非细胞成分都有助于神经胶质瘤的发生，肿瘤微环境的改变可以促进神经胶质瘤的发生、进展、侵袭和治疗耐药性。基质胶作为一种用于体外培养和模拟生物组织环境的生物材料，其物理性质和功能上高度模拟天然细胞外基质的关键特征，为肿瘤细胞提供支撑和3D结构，有助于细胞黏附、生长和分化，可以更完整地在体外模拟肿瘤微环境。PDMS具有透气性、透光性、生物相容性以及易加工和成本低等特征，本研究使用的微流控芯片模型集PDMS应用优势和微流控在时空间维度精确控制的特点，实现模拟体内肿瘤微环境的细胞培养，为脑胶质瘤体外模型构建、药效评价和药物筛选提供灵活可控的研究平台。

脑胶质瘤动物模型因其存在基因和分子水平特征、肿瘤微环境等与人类存在差异、低通量、耗时长以及伦理问题等问题，细胞模型仅由肿瘤细胞组成，易发生遗传变异和缺乏肿瘤微环境等缺点，导至脑胶质瘤候选治疗药物在临床前试验评估的失败率极高。与动物模型和传统的贴壁培养的细胞模型相比较，本研究采用人源的U251细胞构建的脑胶质瘤微流控芯片模型在形态、结构以及缺氧微环境的表达等方面更接近真实的肿瘤生长环境。作为体外研究模型，肿瘤细胞在该微流控芯片模型内的存活率、凋亡和对治疗的反应等方面表现出更接近体内的行为，更真实地评估模型内肿瘤细胞对药物或其他外界刺激产生的反应。因此，本研究中建立的微流控芯片模型在研究肿瘤生长、侵袭、药物评价和筛选具有一定优势。

脑胶质瘤的标准治疗包括最大限度的手术切除、随后的放疗和TMZ同步化疗，但许多小分子抑制剂和免疫治疗策略都未能改善预后。中医药治疗脑胶质瘤具有一定优势，包括改善临床症状、减轻放疗和化疗的不良反应、提高患者生存质量等。目前认为中医药防治脑胶质瘤的作用机制主要与改善脑胶质瘤免疫抑制微环境，促进脑胶质瘤细胞凋亡及抑制其增殖、侵袭、迁徙，抑制脑胶质瘤组织内血管生成，调节BBB通透性，促进氧化应激相关，同时还能够提高肿瘤细胞对放化疗的敏感性，减轻其不良反应，降低肿瘤耐药性和复发的风险。中药半枝莲具有清热解毒，化瘀利尿的功效，现代药理研究表明半枝莲具有抗肿瘤、抗病毒、抑菌、消炎等作用，可通过抑制血管内皮生长因子、缺氧诱导因子、基质金属蛋白酶的表达等，调控相关信号通路的相互作用，抑制脑胶质瘤血管生成网络机制的形成，发挥抗胶质瘤发生和发展的作用。有研究发现半枝莲80%乙醇提取物对人胶质瘤细胞具有明显的抑制迁移、侵袭作用，并具有浓度相关的抑制细胞存活率、促凋亡活性。He等研究发现半枝莲活性成分野黄芩苷对人胶质瘤细胞U251和LN229的增殖、迁移和凋亡均有抑制作用，其作用机制可能与抑制PSEN 1/PI 3 K-AKT信号通路有关。相比之下，本研究利用所构建的更具生理相关性的脑胶质瘤微流控芯片模型评价半枝莲抗脑胶质瘤作用。结果显示，2 mg/ml的半枝莲提取液能降低U251细胞的活力，通过降低线粒体膜电位诱导细胞凋亡，为进一步探究半枝莲治疗脑胶质瘤及其作用机制提供实验基础。

综上，本研究采用2D和3D培养方式构建了模拟肿瘤微环境的脑胶质瘤微流控芯片模型。综合芯片上细胞活力评价、肿瘤微环境表征以及两种抗肿瘤阳性药物对该模型进行表征并验证。该模型成功应用于中药半枝莲的抗脑胶质瘤药效评价，阐释了半枝莲通过诱导脑胶质瘤细胞的凋亡发挥抗脑胶质瘤作用，为中药抗脑胶质瘤药效评价、机制研究以及活性成分快速筛选提供研究平台。

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