Western Blotting技术之转膜

青草

在蛋白免疫印迹实验中，转印是电泳之后的步骤。该步骤将蛋白从凝胶基质移动到合成膜支持物上，并与膜相结合，形成印迹。


电转印是蛋白免疫印迹中最常见的转印方法，即使用电场力驱动蛋白从凝胶中洗脱转移到膜上。此过程中，膜和凝胶放置在一起，并在两个电极之间放置滤纸。在电极之间施加电压，蛋白在电场力的作用下迁移到膜上。

电极之间产生的电场强度（以V / cm为单位测量）是实现转印的驱动力。电压及电极间距都会影响蛋白从凝胶中洗脱的速率。针对不同分子量的蛋白需要进行转印条件优化，以防止转印不足（蛋白不完全从凝胶中转移到膜上），或转印过度（蛋白穿透印迹膜造成损失）。

转膜流程：
1选择转印的方法及设备：可选择传统湿转、半干转或最新的快速半干转 方法。
2准备转印缓冲液及试剂：准备足够的转印缓冲液，用于转印槽以及凝胶、膜的预平衡。
3预平衡凝胶和膜：如有必要，用 转印缓冲液预先平衡凝胶和印迹膜。
4组装凝胶和膜的“三明治”：将凝胶和膜放置在被缓冲液浸湿的滤纸之间，做成转印“三明治”。
5转印过程：将“三明治”放入转印槽，并加入转印缓冲液，选择合适的转印条件，开始转印过程。

转印设备和过程主要有三种：
湿转系统，半干转系统和快速转印系统。

湿转系统
湿转系统适用于大多数各种分子量的常规蛋白转印。转印过程中凝胶和膜被浸入充满转印缓冲液的槽中。




半干转系统
凝胶和膜被夹在预先润湿缓冲液的滤纸之间，滤纸与平板电极直接接触。半干转系统的安装使用比湿转简单。




快速转印系统
快速转印系统是最近发展出来的技术，使用专用设备、专用滤纸及专用缓冲液来快速有效地转印蛋白。通常滤纸和湿润的膜预先放在一次性包装中，简化了转印“三明治”的组装。




转印膜种类
硝化纤维素膜和增强型硝化纤维素膜
硝酸纤维素膜很容易在水或转印缓冲液中润湿，并且与多种蛋白检测方法兼容。无支持的硝化纤维素很脆，不建议用于抗体剥离及重孵育实验。增强型硝酸纤维素膜是含有惰性支撑结构的硝酸纤维素膜。这种额外的支撑使膜具有更高的强度和弹性，可以用于抗体剥离及重孵育，并可承受高压灭菌（121℃），依然保持硝酸纤维素的易润湿性。

聚偏二氟乙烯（PVDF）
PVDF 膜具有很强的蛋白结合能力（约为硝化纤维素的两倍），并且在通常的处理中不易破裂，因此可以用于抗体的剥离和重孵育实验。低荧光背景的PVDF膜结合了PVDF的优势，并且在很宽的波长范围内具有低自发荧光。在长时间曝光情况下，不会增加背景荧光水平，有利于检测微弱的荧光信号。

膜通常有两种孔径可供选择：
大多数免疫印迹实验，可使用孔径为0.45 μm 的膜
0.2 μm 孔径的膜适合转印低分子量蛋白 (<15,000 kD)，低分子蛋白有可能穿过较大孔径的印迹膜

转印技巧
去除气泡
均匀的蛋白质转印需要三明治的各组件之间完全接触，尤其是凝胶和膜完全接触。气泡会导致膜上出现空白点，蛋白转印时会在气泡周围“流动”，因此请使用凝胶滚轮将这些气泡赶出！提示：梯度凝胶最好上下滚动，而不是左右滚动。左右滚动会导致梯度凝胶翘曲和起皱。




转印前的预平衡
湿转和传统半干转时，将凝胶电泳缓冲液替换为转印缓冲液可获得更好的转印效果。电泳缓冲液的带入会增加电导率，从而导致转印过程中产生过多的热量。可在水中短暂冲洗凝胶，然后在转印缓冲液中平衡凝胶15分钟，平衡膜5分钟。请注意，对于某些快速转印系统，不建议使用凝胶预平衡，请遵循制造商的操作指南。

避免膜变干
在转印之前和之后均需保证膜的湿润，从转印三明治中取出后，转印热量会使膜容易变干燥。对于PVDF膜尤其重要，因为PVDF膜是疏水的。应迅速将膜浸入预先准备好的缓冲液中，以免膜干燥。如果干了，可将硝酸纤维素膜重新在缓冲液中浸湿，而PVDF膜则需要在醇中重新活化。

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