分子诊断---STR鉴定技术灵敏度堪忧？普遍还是个例？

笑看风云

STR鉴定技术背景
STR（Short Tandem Repeat，短串联重复序列）是指DNA序列中存在的一种特殊模式，即一串较短的核苷酸序列重复排列。
在个体身份鉴定方面，STR检测被广泛应用于法医学领域，如刑事侦查，失踪人口鉴定，灾难遗体识别等。同时，STR检测也是目前亲子鉴定的金标准方法，其准确性和可靠性得到了广泛的认可。
在细胞鉴定方面，2011年美国国家标准学会发布了一份专门的细胞STR鉴定标准，ChP（中华人民共和国药典）也规定了细胞系质量控制的STR试验。STR基因分型已被ICLAC、ATCC等权威机构作为金标准应用于细胞鉴定。



Fig 1. STR检测技术的原理

近年来，法医物证鉴定中遇到了许多新挑战，尤其是在提取和检测混杂样本（如含少量嫌疑人DNA的死者样本）时，现有的毛细血管电泳结合PCR技术（Capillary Electrophoresis PCR, CE-PCR）在灵敏度上的局限性逐渐显现，难以应对复杂、微量DNA样本的鉴定需求。同时在科研细胞培养过程中，如果存在轻微的细胞交叉污染，现有的STR检测技术也无法准确检测出。因此，我们亟需寻找更高灵敏度、更先进的分子检测技术，以提升鉴定效果和可靠性。
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实验设计
为了更全面了解市场上CE方法在鉴定细胞污染时的检测限，科佰生物设计了一项实验：对比不同公司检测服务的灵敏度和准确性。科佰生物使用ddPCR技术（数字PCR法）准确制备了不同比例的细胞污染混合gDNA样本：10%污染样本，20%污染样本和30%污染样本，将上述样本分别送至三家检测公司（标记为A、B、C），并采用其CE方法进行检测，对比各公司检测结果的灵敏度、准确性和重现性，评估其在不同污染比例样本中的表现。
实验结论
三家公司均未检测出10%的污染样本，有两家检测出20%污染样本和30%污染样本，但是分析未报出全部差异位点，一家三个污染样本均未检出。通过分析结果发现，除了与CE的灵敏度相关外，与实验人员对结果的判读也有很大关系。



Fig 2. 不同污染占比浓度的STR样本在三家公司Penta E基因座的STR检测结果图，其他20个基因座有类似的情况，文中不一一罗列。

实验分析

• 现状与挑战
  传统STR技术的局限性：STR（短串联重复序列）作为法医DNA鉴定的“金标准”，在检测混合样本及微量DNA样本时，其灵敏度受到限制。尤其对于死者样本中含有少量嫌疑人DNA的情况，毛细血管电泳技术可能无法有效检出。
  受到MSI（微卫星不稳定性）检测的启示：MSI伴随诊断试剂盒，检测限可达30%。虽然MSI主要针对单核苷酸和二核苷酸重复序列，技术难度较高，但也提示我们，四核苷酸重复序列的STR可能具备更高的灵敏度开发潜力。
  新兴技术的可能性：NGS（下一代测序）和dPCR（数字PCR）技术作为更为精准和灵敏的分子检测工具，已在临床、科研等领域展现出巨大的应用前景。将这些技术应用于STR检测中，或许可以突破现有STR检测的灵敏度瓶颈。
  
• NGS与dPCR在STR检测中的优势
  

NGS技术

• 高灵敏度与多位点检测：NGS可实现对多个STR位点的深度测序，提高检测灵敏度，尤其适用于复杂混合样本的分析。
  
• SNP与STR结合：已有公司推出基于SNP的NGS方法，这为STR检测提供了新的思路。将NGS技术与STR检测相结合，可提高样本分辨率与灵敏度。
  
• 溯源与个体识别：NGS可以实现对微量DNA样本的高通量检测，区分相近细胞系，同时还可以检测细微的污染，同时针对鼠源以及人源，不需要做二次实验。
  

dPCR技术

• 超高灵敏度：dPCR通过将DNA样本进行绝对定量分割，可实现对极微量DNA的精准定量，检测灵敏度远超传统PCR技术。
  
• 绝对定量与低丰度检测：dPCR在低丰度DNA检测方面优势显著，特别适用于微量DNA或高混合度样本的分析。
  
• STR位点检测的潜力：将dPCR技术应用于STR检测，可进一步提升微量DNA的检出能力，弥补传统PCR的不足。
  

• 倡议与发展方向
  

面对快速变化的科学需求和技术挑战，STR技术的进一步升级迫在眉睫。为推动STR技术创新与优化，满足更高精度、更广泛应用的需求，我们特此发出倡议：

• 研发更高灵敏度的NGS-STR方法：结合NGS的高通量与精准性，开发针对STR位点的高灵敏度测序方法，用于混合样本鉴定。
  
• 探索dPCR在STR检测中的应用：优化数字PCR技术，使其能够精准检测微量、低丰度的STR位点，尤其是复杂背景下的样本。
  
• 多技术融合：整合NGS、dPCR与SNP分析，形成灵敏度更高、分辨率更强的法医物证鉴定体系。
  
• 其他方法学。
  

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倡议书

针对行业内的单位，我们倡议一次行业内的自我能力验证，科佰生物提供如下标准品，提供20个免费试用装，给内部体系做一次体检。
STR相关标准品，主要包含了常染色系列、性染色体系列、人源污染检测系列，以及种属污染。
更多标准品，请访问科佰生物网站。

• 常染色体系列，分为男性（9948）和女性（9947）两个标准品：
  包含常用的20个STR位点(含13个CODIS 位点) 和一个性别位点Amelogenin。
  

• 性染色体系列：
  X染色体标准品包含19个X-STR基因座和一个性别位点Amelogenin。Y染色体标准品包含22个低频突变Y-STR基因座和7个高频突变Y-STR基因座。低频突变和高频突变基因座相结合具有更高的个体识别能力，提供了强大的兼容性和排查能力。
  

• 人源污染检测STR标准品
  

包含了10%污染样本，20%污染样本以及30%污染样本（该占比为gDNA的质量占比），不同污染梯度能够帮助确定检测方法的检测限，尤其是在现实应用中，是否能检测出污染样本，往往影响实验结果的准确性。


Remark*:The relative intensity of the 12 allele is less than 10 % of the dominant 10 allele.
倡议单位：
科佰生物科技有限公司
日期：
2024年12月18日

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/21598963060