单细胞功能蛋白质组学微流体研究进展（上）

微流控芯片

单细胞蛋白质组学（SCP）通过分析单个细胞、其生物学状态和信号激活后的功能结果来揭示表型异质性，而这些特征很难通过其他组学特征来探测。这对研究人员来说很有吸引力，因为它能够更全面地了解细胞过程、疾病发生和进展背后的生物学细节，并促进从单个细胞中识别独特的生物标志物。基于微流体的策略已成为单细胞分析的首选方法，因为它们允许简单的检测集成，如细胞分选、操作和含量分析。值得注意的是，它们一直是一种使能技术，可以提高最近开发的SCP方法的灵敏度、鲁棒性和可重复性。微流体技术的关键作用预计将在推进SCP分析的下一阶段进一步迅速扩大，以揭示更多的生物学和临床见解。在这篇综述中，我们将捕捉到微流体方法在靶向和全局SCP方面的最新成就，包括提高蛋白质组覆盖率、最大限度地减少样本损失、提高多路复用性和吞吐量的努力。此外，我们将讨论SCP的优势、挑战、应用和未来前景。

复杂的生物系统受到单个细胞动态变化的调节，包括细胞类型及其生物状态，以及它们与细胞微环境的相互作用。在许多情况下，群体的常规集合测量不能代表单个细胞的确切状态，因为它平均了不同细胞之间的差异。这种异质性对正常和病理样本的影响促使在基因组、转录组和蛋白质组水平上进行单细胞分析。基于组学的分子图谱在单细胞水平上的出现是最近生物学研究中最重要的突破之一。在过去的二十年里，基因组学和转录组学的技术进步逐步推进，由于遗传扩增的可行性，能够从单个细胞中表征整个基因组和转录组。虽然最近的报告表明蛋白质组图谱与mRNA表达相关性较差，但由于缺乏扩增策略和蛋白质组的广泛动态范围，分析单个细胞的蛋白质组一直具有挑战性。为了阐明翻译过程中缺失的推理，有必要对蛋白质进行全面表征，以补充单细胞水平的遗传测量。

单细胞蛋白质组学（SCP）是一个快速发展的研究领域，其在研究生物系统中的应用揭示了关于同基因细胞间表型和同一细胞内细胞过程的大量关键见解。 SCP分析主要作为靶向和非靶向（全局）方法开发。基于标记的亲和探针（如抗体），采用靶向方法检测分泌和细胞内蛋白质。另一方面，质谱（MS）是全球蛋白质组学分析的主要仪器，已被广泛用于从大样本中提取接近完整的蛋白质组。然而，在使用传统的蛋白质组学制备工作流程时，MS的可行性和灵敏度在单细胞水平上受到了严重损害。

为了解决这些局限性，人们付出了巨大的努力来实现样品制备的小型化、分析工作流程的优化和仪器的集成，旨在实现更简化的SCP协议，同时将样品损失降至最低。特别是微流体，非常适合并应用于此类工作。它是一个多学科平台，用于将纳米到毫微微升的流体样品精确处理、观察和加工到所需的微工程隔室中。此外，基于微流体的方法具有成本效益分析、样品和试剂消耗低、反应动力学增加和接触面积减少的内在特性，从而产生更灵敏的检测结果。在过去的十年中，微流体系统作为多任务平台蓬勃发展，通过多功能集成、多路复用能力和最大化吞吐量，可以促进单细胞研究（图1）。使用微流体系统的整个蛋白质组学工作流程可以在几纳升的体积内进行（例如一锅协议），大大减少了样品损失。然而，尽管如此，由于整体系统集成、所需的蛋白质组覆盖率和所需的灵敏度，使用MS和微流体的SCP研究仍然具有挑战性，例如检测从高丰度到低拷贝数的蛋白质。由于异质单个细胞表达由内在和外在因素引发的独特蛋白质组，它们在临床医学进步和更广泛的细胞生物学探索中的作用必须由SCP技术来解决。很少有评论讨论基于微流体策略的SCP发展，但他们的大部分重点要么是多组学方法（很少强调基于MS的SCP），要么是微流体技术的基础。在这篇综述中，微流体的最新发展。将系统地讨论基于SCP的SCP，包括其独特的特征、优势、局限性、应用和未来前景。我们将介绍微流体和单细胞蛋白质靶向分析的能力，然后详细描述基于MS的全球SCP分析的最新微流体方法，特别关注样品制备的小型化、增强的蛋白质组深度以及这些方法所揭示的生物信息。最后，我们将讨论推进SCP领域的挑战和机遇。

2.用于生物分子分析的微流体技术发展到单细胞水平

从历史上看，微流体器件的诞生与微电子和半导体器件制造的开始相关。自从第一个芯片实验室器件被证明是一个小型化的色谱系统以来，已经开发了种不同的微流体系统，如全化学分析系统（TAS）、液滴微流体、数字微流体和许多其他系统，以满足各自的研究需求。在值得注意的发展中，G.Whitesides等人引入了软光刻微图案技术，该技术允许使用弹性体材料聚二甲基硅氧烷（PDMS）使用复制模制造图案转移元件。随后，S.Quake等人应用软光刻技术制造多层通过嵌入式阀门和蠕动泵实现定制流体控制的微流体。从那时起，微流体系统在生物工程、生物医学科学，为了进一步将生物分子敏感性降低到单细胞水平，减少试剂消耗和有效收集细胞内容物起着关键作用。在以下部分中，讨论了细胞处理的一些选定工作，包括细胞分离、操作、裂解以及与下游仪器的微流体接口。

2.1用于细胞处理的微流体装置

单细胞方法要求在后续样品处理之前分离单个细胞。因此，细胞处理技术已被纳入各种微流体平台进行生物研究。下面简要讨论了典型的单细胞方法，包括液滴、微柱、微孔和集成阀阱。在液滴微流体中，通过在不混溶的载液中分割形成液滴的水流，将单个细胞与其他试剂一起包裹起来（图2a（i））。通过调节不混溶流体的不同流速来控制液滴大小，从而在几秒钟内产生数千个液滴。微柱阵列利用形态陷阱来限制细胞的运动，从而在细胞悬浮液流过时捕获它们。细胞捕获通常需要几十秒，微柱可以进行化学功能化以提高效率和选择性（图2a（ii））。个细胞捕获微孔通过将孔模制成与靶细胞大小相当的尺寸来利用尺寸依赖的捕获。开放式井制造的便利性提供了可调节的可扩展性和功能性，这对于高通量工作流程来说是理想的（图2a（iii））。另一种方法利用压力控制阀，结合微通道电路来捕获细胞。这种方法允许在同一芯片上集成一系列操作，实现自动化和并行化（图2b（iv））。除了上述方法外，还应用了额外的功能，如声学（图2b（i））、个光镊（图2b（ii））、个磁学（图2b，iii）、和介电电泳（图2b，iv），以促进细胞处理和按需分选。这些细胞分选技术利用外部力场来偏转靶细胞在通过微通道时的流动路径。由于芯片设计的灵活性，基于微流体的单细胞方法易于集成到下游的细胞操作和分析中，这是大多数现成的细胞分选仪器无法提供的功能。

2.2细胞裂解微型装置

为了最大限度地提高分析灵敏度，能够有效提取细胞内内容物的细胞裂解方法非常重要。因此，多种微流体已被证明可用于片上细胞裂解。Chen等人制作了一种三层结构（PMMA硅片PDMS），用于预处理大鼠全血，并通过基于洗涤剂的裂解在50分钟内从白细胞中提取PCR可扩增DNA。Irimia等人协调了带有阀门的热气动执行器，在微室中混合单细胞悬浮液和微裂解洗涤剂（25 pL），通过沿液气界面的虚拟壁抽出空气来实现细胞裂解。Sasuga等人提出了另一种在pL级微孔上进行的化学裂解。这种方法遵循典型的基于微孔的细胞操作，其中裂解试剂通过流动池（在PDMS板和由双面胶带粘合的玻璃盖玻片之间），以允许单细胞测量细胞内蛋白质。同时，为了避免样品清理步骤，使用微流体装置开发了无洗涤剂的裂解方法，如通过机械（图2c（i））、激光（图2c 为了实现热解，在硅基底上沉积了一个温度传感器和一个微型铂加热器。此外，还配备了无线感应加热器来加热大面积的表面，一次可以处理大量的样品（图2c（iii）））请注意，上述微流体促进的细胞裂解方法不一定用于蛋白质组学研究，尽管如此，它们可能会改善SCP分析。总的来说，微流体使用不同的模式提供了受控的裂解能力，这些模式可以根据单细胞测定进行调整。更重要的是，该功能可以很容易地与微流体中的现有功能模块集成，以构建简化的工作流程，避免样品损失（由于样品转移），从而提高灵敏度。

2.3微流体与下游检测技术的集成

成功地将微流体与分析技术相结合，如基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）和液相色谱质谱（LC-MS），提高了蛋白质组学分析对质量有限样品的灵敏度。在本节中，我们重点介绍了微流体与LC-MS的集成。潘等人开发了一种单探针，这是一种直接与质谱仪耦合的小型化接口设备。这种方法省去了标准质谱样品制备，并与质谱入口兼容，允许实时单细胞质谱分析。此外，为了应对电离性较差的样品的挑战，Huang等人引入了配备三合一设置（即取样、溶剂注入和ESI）的双探针微芯片（图2d（i））。在大多数基于质谱的蛋白质组学分析中，通常需要超高压样品分离，以提高质谱读数的分辨率并缩短分析时间；然而，这一特征通常会导至微流控芯片故障和连接器泄漏。为了解决这个问题，Eeltink的团队最近开发了一种微流体调制器芯片，用于与高压LC操作（高达65 MPa）对接。同样，Chen等人还提出了一种耐高压的3D打印多层微流体芯片，可以在LC-MS系统中在4 MPa的背压下运行。接口芯片有两个入口，一个连接到LC，另一个用于颗粒填充，一个出口连接到质谱仪（图2d（ii））。总的来说，将功能模块集成到微流体中并将其直接与LC-MS系统耦合的努力在简化工作流程方面具有诱人的前景，可以显著减少样品损失并提高分析灵敏度。为单细胞蛋白质组学开发的方法在所需的灵敏度和更深入的蛋白质组学覆盖方面还处于早期阶段。

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