流式细胞三大革新！光谱/纳米/液滴技术如何突破检测瓶颈？

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流式细胞也不是一个新的技术了，它诞生于1965年，到现在刚好六十年。从这项技术问世以来，它就是临床和实验室研究的基石，在免疫表性分析、诊断、细胞计数和细胞周期分析等领域都有着广泛的应用。
通过光散射和荧光来评估细胞的特性，流式细胞成为了一种非常强大的多参数细胞表征工具，就是样本组成比较复杂，或者是好几份样本混合在一起也没有问题。
悬浮在生理盐水溶液中的细胞以单列的方式流过激光光源——这一过程被称为流体动力聚焦——当激光照射细胞时，任何向前散射的光（前向散射，FSC）提供有关细胞直径的信息，而向侧边散射的光（侧向散射，SSC）则提供有关细胞颗粒度的信息。
接下来，我们就可以通过荧光染料或荧光素偶联抗体，进一步对细胞进行表型特征分析。
当然，流式细胞仪还可以用于细胞分选，即物理分离细胞成不同群体，这被称为荧光激活细胞分选。



这些年来，流式细胞的进展主要体现在能够同时测量参数的数量不断增加，但基于荧光的多色流式细胞基本过程是保持不变的。
在早期，流式细胞仪只能分析一到两个参数，当当代基于荧光的设备可以同时测量30个参数。
但这也意味着流式细胞达到了技术瓶颈，每个颜色通道都需要自己的探测器，而在单台设备当中能够增加探测器的数量是有限的，这也就成为了一个限制因素。
而且，传统流式细胞技术面临的挑战不仅仅只有这个，还包括像检测限相对结果，对结果的解释比较主观、荧光素不稳定，以及需要大量质控品等等。
需要一些新鲜的血液。
有很多出色的工程师在努力解决这些问题，他们的奇思妙想也显著推动了流式细胞领域的发展，比如光谱流式细胞、纳米粒子细胞术和液滴细胞术。
一系列近期的进展正在解决这些挑战，并显著推动流式细胞领域的发展，包括光谱流式细胞、纳米粒子细胞术和液滴细胞术。
这些进展提高了流式细胞的准确度和效率，同时也扩展了新的研究和临床应用领域。
今天我就给大家介绍一下这几种新的流式技术。
光谱流式细胞——查看完整的光谱图
在传统的多色流式细胞当中，荧光素标记的探针被相应波长范围的激光激发的时候，就会产生荧光信号。
每个荧光素的峰值发射光会被一系列分色镜和带通滤光片被分离，最后被单个探测器捕获，这也是探测器数量成为限制因素的原因。
另外，随着参数的增加，我们必须使用更多的单荧光素，而它们的发射峰也越来越接近，这就使得整个实验变得非常复杂。
光谱流式细胞就是为了克服这个问题而发展出来一种技术，它通过一系列探测器去捕获每个荧光素的完整发射光谱，从而解决了这个问题。
一位流式方面的大佬曾经和我讲：“小刘，你知道不，多色流式细胞大概最多能做28到30中颜色，物理规律就是这么定的。但这个光谱流式细胞就厉害了，我们根本不担心颜色限制的问题，因为压根不知道上限在哪！”



光谱流式细胞，是用多个探测器去捕获每个荧光素的发射光谱，从而能够区分具有重叠发射峰的荧光素。
为了能够量化每种荧光素的信号，那必须对光谱进行分离，然后再使用光谱解混算法，通过与单染对照的比较，来拟合和识别单个荧光素。
光谱流式细胞还有一个好处，就是是它对主观的手动补偿的依赖性较小。
毕竟，补偿是很吃个人经验的，老手和新手之间的差距比较大，而光谱解混的数学原理与补偿的数学原理在在本质上是相同的，同时它还是以自动化的方式进行，这就让它的一致性更好，而且准确度更高。
就像我在其他文章当中谈到的那样，讨论一个技术的前景，不能只看技术本身，还要看它的应用场景。
光谱流式细胞可以计算细胞的自发荧光，并且将其视为另一个通道，这就能够减少复杂样本中的噪声，并且在高度自发荧光样本——比如血液——当中，识别罕见细胞亚群的能力也得到了提高。
对于癌症研究来讲，这个技术特点也非常有价值，特别是对于研究免疫标志物的细微变化，以及对新疗法的复杂肿瘤浸润特征分析方面。
当然，还不要忘记光谱流式细胞最强的一方面——多重检测。
在当前，光谱流式细胞已经可以在一次试验当中跑50种颜色，当然这个数量还会增加，也许最后能达到100种。
如果一次就能观察100种生物标志物的话，也许在症状出现之前，就可以对患者生理环境的变化进行预测了。
纳米粒子细胞术——纳米尺度下的生命
诚然，流式细胞技术在细胞表征方面发挥着重要的作用，但它也被局限在对细胞内或细胞表面的生物标志物进行检测的范围内。
对于那些分泌在细胞外的生物标志物，像蛋白质、代谢物，或者细胞外囊泡（EVs）中的分子，在传统流式细胞仪当中是很是被检测到的，就算检测到了信号也比较暗。
这也没办法，毕竟，传统流式细胞的检测限是比较高的，灵敏度不太够。
但还是那句话，场景决定技术，随着EVs的重要性越来越受到重视，也就需要一种更全面的检测方法来了解EV中成分分布的情况

EVs是一种细胞分泌到细胞外环境中的纳米大小囊泡，它主要是用于在细胞间运输一些物质。作为一系列生理功能和过程（如衰老和免疫反应）中的重要生物标志物以及其潜在的临床应用而越来越受到重视。

对于EV检测，传统上是使用PCR或者质谱分析方法，这种方案可以测量样本当中EV成分的总量，但是，这两种方法在识别信息性生物标志物或生物活性内容物方面的能力是有限的，不能全面了解这些成分的分布情况。
偏偏这两个方向，又是EV研究的关键转化目标。
需求就在这里，看问题怎么解决了。
斯金蒂隆研究所就开发了一种用于分析EVs、EVs的形成以及与细胞的相互作用的新工具——包括定制的纳米粒子流式细胞仪以及经过优化和验证的检测方法。
这种流式细胞仪可以检测尺寸小于40 nm，而且分子数量不超过10个的目标。
检测限确实更低了，但新的问题也就来了——检测限越低，重复性往往就越不好，这就导致结果经常不一致。
为了解决这个问题，斯金蒂隆研究所参加了一个工作组，它的目标是开发一个标准化EV流式细胞实验报告框架——MIFlowCyt-EV。
在这个报告框架当中，通过设计和优化包含适当阳性和阴性对照的检测方法，校准仪器并以绝对数量和亮度单位报告结果，就能够使不同仪器以及不同实验室之间的检测结果，可以进行比较。
这对于将基础研究实验室的发现，有效的转化为新的临床生物标志物和治疗方法，至关重要。
双重液滴细胞术——教会老细胞仪新把戏
不仅仅是新型流式细胞技术在不断的涌现，传统流式细胞仪也在进行不断的改进。
像液滴微流体技术，就能在10^-15 L的体积内，对数百万个单个细胞或蛋白质进行高通量分析。
虽然这些液滴及其内容物可以进行表型分选，但也存在一些问题，比如，需要定制的、技术要求高的微流体设备，而这些设备，又通常比标准流式细胞仪机器慢，颜色通道也有限。
这个时候，就得用上双重乳化液滴技术了。
这项由斯坦福大学开发的技术，可以使用传统流式细胞仪进行表型分析和分选，从而实现更高的通量和多参数分析。



其中的秘密，就藏在这个双重上面。
双重乳化液滴的核心是一个水滴，它位于油滴的中心，而油滴外面又被水包围，这就有点像细胞膜，对于传统流式细胞仪来说，这些液滴就像一个大细胞，所以可以使用它们来进行分析。
挑战是必然存在的。
油水界面要如何稳定、液滴要如何保持悬浮、如何对传统流式细胞仪进行校准，这些都是需要解决的问题。
AI在这里派上了用场。
研发人员使用机器学习来表征不同变量对液滴的影响，并且创建了一个模型。这个模型可以预测由给定流速和表面活性剂而产生的液滴，然后设计能够产生具有特定参数的液滴的设备。
那，这项技术有什么用呢？
这些液滴在细胞的周围形成了一个外壳，可以使细胞免受流体剪切力的影响，从而让我们能够检查更多的时间或者空间表型，比如，通常会扩散的分泌蛋白。
而且，我们还可以将细胞对封装起来，检查细胞间的相互作用，又或者，将酶与其底物封装起来，检查酶的活性。
举个例子，假设我们现在要对酶进行筛选，找出那些活跃，有功能的变体。
那么，我们就可以把这些蛋白质变体封装在双重乳化液滴当中，并且使用荧光标签，随后，就可以使用高通量流式细胞仪来快速的分选和识别它们了。
这可比传统的筛选方法准多了，也快多了。
荧光会是未来吗？
流式细胞正在快速发展当中，但这些都不是革命性的改变，下一步，也许是量子化，而这有可能在2到3年内就实现。
量子测量会给流式细胞带来真正意义上的飞跃。
一方面，它能检测单个荧光素，从而识别及其罕见的生物标志物；而另一方面，结合单光子探测器，流式细胞将会从一种主观、定性的技术转变为一种完全定量的技术。
当然，就像我在《杀入癌症肿瘤检测领域，数字PCR要革谁的命？》（加入链接）中谈到的那样，技术进步固然可喜，但是最重要的，还是生态，还是得要人去用这项技术。
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