Western Bloting实验结果背景太高怎么办？

非诚勿扰孟非

Western Bloting实验结果背景太高怎么办？
原文地址：https://www.zhihu.com/question/540008448

同花顺

尝试改变封闭剂，优化封闭时间，适当降低抗体浓度。

同花顺

硕博连读的我，已经做了5年的Western Blot,师弟师妹咨询WB操作过程中遇到的问题数不胜数。如今，丫丫我将这些细节和问题展示出来供大家参考。
WB过程的几个阶段：


1、蛋白质的提取
2、蛋白浓度测定
3、WB的操作过程（电泳、电转、封闭、一抗、二抗及发光）
现在就从这几个步骤中需要的注意事项跟大家讲讲：
蛋白质提取的操作和注意事项
011.1组织蛋白提取实验步骤大致分为：预冷lysis buffer→研磨→混悬→超声→离心注意事项：（1）其中蛋白酶抑制剂的种类大致有：PPI、NaF和PMSF等，在组织提取的时候一般加入PPI，在加入lysis buffer时前就加入蛋白酶抑制剂。021.2 细胞蛋白提取实验步骤大致分为：培养液去除→PBS清洗细胞→加蛋白裂解液→用枪单孔加入裂解液并吹散→枪头刮板（斜圈）→用枪头裂解液冲刷板孔干净并装入新EP管并放置冰上→超声→离心→放置冰上注意事项：（1）加裂解液PMSF，现配现用，且最后再加入（2）用PBS清洗细胞时，不可碰壁和细胞，需沿壁缓慢注入，防止污染
总结
在蛋白质提取的这一阶段中，裂解液的选择尤其重要，里面一般含有去氧胆酸钠和NP-40、Triton-x-100和SDS，这些都是去污剂，根据以上药品加入的浓度可将裂解液分为强中弱三种，要根据实验目的和组织类型加入不同强度的裂解液。Kevin在发表的文献中也曾提过：裂解液的条件对蛋白质的质量和保存条件有重要影响。如：用纯非离子洗涤剂（Triton X-100或NP-40）裂解细胞或组织会导致一些蛋白质在离心后分裂成可溶性和不溶性（颗粒）部分。放射性免疫沉淀法 （RIPA） 缓冲液（含有稀释的十二烷基硫酸钠（SDS，一种变性洗涤剂）和脱氧胆酸盐（蛋白质-蛋白质相互作用的破坏物））被广泛用作全细胞提取的裂解缓冲液。但尽管如此，RIPA缓冲液裂解仍然产生不溶性部分。因此，在做蛋白互作筛选实验时，更需要注意选择裂解液类型了。
下面通过一篇文献看看裂解液条件如何影响免疫印迹结果的。


RIPA裂解液不溶性不仅局限于细胞骨架蛋白和细胞外基质蛋白，而在转录因子GATA2和细胞-细胞粘附蛋白、β -连环蛋白也存在。因此，在WB之前，需先确定目标蛋白质，再选择合适裂解液。了解各种裂解缓冲液中的蛋白质溶解度是做WB成功的关键！


在这一步骤中，最关键和需要注意的地方就是选择裂解液的问题。（1）裂解物蛋白的稳定性和翻译后修饰也会受到混合细胞酶（蛋白酶和磷酸酶）活性的影响


由于篇幅的影响，今天就讲到蛋白质提取阶段。后续接着讲解下一步骤！下周见！

清风寡欲

1\封闭不充分或者封闭液不合适。（如果目的蛋白是磷蛋白，封闭液不能使用奶粉。）
脱脂奶粉：虽然便宜，但使用范围比较窄，磷酸化抗体也回导致背景增加。因为自身含有生物素，不能用于生物素标记的抗体系统。
BSA: 使用范围广。
血清： 某些血清汇总含有叠氮钠，不适用与HRP酶标的检测体系。
2、抗体孵育浓度过高，时间过长、温度过高。
3、 洗涤次数和时间不够。
4、膜干燥（膜要抑制保持湿润状态）。操作过程要保持膜的整洁，不要用手接触膜和按压膜的任何部位。
5、二抗的肺特异性结合。（做二抗对照排除）
6、显影曝光过度。

卡卡

可能的原因及建议：
(1) 膜没有完全均匀湿透
根据所用的膜使用甲醇或转膜buffer浸透膜。
(2) 膜被污染
禁止裸手触摸膜，拿取膜时，使用镊子夹取膜边缘，避免膜被杂蛋白和油脂
污染。
(3) 封闭不充分
选用合适的封闭液，并且封闭足够的时间。
(4) 洗膜不充分
增加洗液体积和洗涤次数，洗液中添加Triton X-100。
(5) 一抗孵育不当
降低一抗浓度，减少孵育时间，改用低温孵育。换用特异性更好的一抗。
(6) 二抗孵育不当
降低二抗浓度，缩短二抗孵育时间。
(7) 检测过程中膜干燥
任何时候都应避免干膜。
(8) 曝光过度
缩短曝光时间。
另外，NC膜的背景通常比PVDF膜的背景更干净，可以选择使用NC膜。