空间蛋白质组学荣膺《Nature Methods》2024年度方法

检验之星

近日，《Nature Methods》评选出“2024年度方法”，空间蛋白质组学凭借其突破性的技术创新和广泛的应用潜力荣膺桂冠。这一领域通过解析细胞、组织及器官中蛋白质的空间分布，为揭示生物系统的复杂性提供了全新视角，同时在个性化医疗、癌症研究等领域展现出强大驱动力。



图1.Nature Methods封面[1]

随着技术的快速发展，空间蛋白质组学已突破传统方法的局限，为研究蛋白质在细胞和组织中的空间分布及相互作用提供了全新视角。当前主要的技术包括：
01 经典技术
IHC和IF是空间蛋白质组学研究中最早应用的经典技术。免疫组织化学（IHC）是最早应用的技术之一，它使用特异性抗体与组织中的目标蛋白质结合，并通过染色反应可视化目标蛋白质的位置和表达水平，IHC技术简便易用，能够提供目标蛋白质的位置信息，适用于大多数实验室环境。其次，免疫荧光染色（IF）是在免疫组织化学基础上的进一步发展。它利用荧光标记的抗体来标记目标蛋白质，通过荧光显微镜可视化蛋白质的空间分布。IF技术具有高灵敏度和多色染色的能力，因此成为研究蛋白质亚细胞定位和相互作用的重要工具。
然而，这些技术的分辨率有限，难以检测低丰度蛋白，同时对抗体的特异性和质量高度依赖，背景信号可能干扰结果。此外，它们缺乏定量能力，无法直接提供蛋白质的绝对表达量信息。

02 基于高分辨率质谱技术
目前空间蛋白组应用原理最简单，最广泛的方法是关注切片中的哪一个部分，就使用激光捕获显微切割技术（LCM）切割组织切片中感兴趣区域，再提取蛋白质用微量质谱方法检测和分析。空间蛋白质组学技术，运用LCM技术在显微镜直视下从器官或组织切片中，按照指定的圈画区域准确获取某个特定的细胞群，其分辨率高至0.005~0.01mm^2（约50个细胞）。通过细胞级的精细切割，和稳定无污染的收集，保障了空间蛋白质组研究的精细度和准确性，允许研究人员在组织样本中精确地定位和采集感兴趣的细胞区域。



图2.利用激光捕获显微切割后进行质谱分析流程（LCM-MS）[2]

质谱成像技术（IMS） ‍‍‍是一种结合质谱分析与组织切片的强大工具，能够在原位对组织中的蛋白质进行定量分析和空间成像。该技术通过微米级激光束照射经预处理的组织样品，将分子电离后引入质谱分析仪进行肽段识别。同时，通过光栅扫描生成组织图像，精确记录扫描点的位置及其对应的质谱数据。IMS在几十微米分辨率下可同时检测数十至上百种蛋白质或多肽片段，为组织蛋白质组学研究提供了前所未有的空间分辨能力。然而，其应用仍面临一些局限性，IMS通常依赖于传统的组织病理学染色（如HE染色）来识别并指导兴趣区域的解析，这增加了实验复杂性和时间成本。
此外，尽管具备微米级分辨率，IMS仍难以实现对特定亚组织结构的高精度解析，尤其是在需要纳米级分辨率的应用中。作为一种非偏倚的蛋白质组学技术，IMS在特定区域内难以实现基于蛋白质密度与空间分布距离的精确定量。‍‍‍



图3.质谱成像技术分析流程

MIBI技术在一定程度上弥补了IMS的不足，将空间成像与质谱分析结合，特别适用于肿瘤微环境的高精度成像研究。该技术是使用金属同位素元素作为抗体标记的报告标签，对FFPE组织切片进行检测。该方法可同时分析多达100个靶标，并结合传统组织学染色，重建虚拟组织图像与抗体表达数据。优势在于能够在肿瘤微环境中实现高度多通量的靶标检测，为空间蛋白质组研究提供新的维
度。然而，该技术检测靶标严格限制在100个，同时，硬件设备昂贵、同位素标记抗体成本高、组织固定基质要求严格，以及可选择的同位素种类有限，均限制了MIBI在大规模研究中的推广应用。
基于质谱的空间蛋白质组学技术的发展显著提升了组织和细胞水平的蛋白质解析能力，但仍面临样品制备复杂、分辨率限制、定量能力不足和高成本等挑战。
03 多靶标成像技术
基于测序的空间蛋白组技术比较常见的就是GeoMX DSP（Digital Spatial Profiler）技术，其核心特点是为每种抗体添加了特异性的寡核苷酸标签。相比传统的荧光标记循环成像技术，GeoMX DSP利用紫外光释放标记在抗体上的特异性寡核苷酸标签序列，然后通过nCounter读数定量来收集这些标签。此技术不仅免去了荧光基团的使用，还能够对组织切片进行多重免疫荧光的预处理，提前展示切片的形态学特征。用户可以选择目标关注区域进行针对性的蛋白表达特征检测，单个区域的细胞数量可低至5-10个，这极大提高了研究效率。目前，该技术已经能够检测近100种蛋白，涵盖了肿瘤、免疫和神经相关的功能蛋白。



图4.GeoMx DSP 工作流程（图片来自Nanostring官网）

基于荧光成像的空间蛋白组技术比较有代表性之一是美国AKOYA公司开发的CODEX（Co-detection by indexing）单细胞蛋白组学分析平台。CODEX的核心设计包括两个关键部分：检测试剂和成像试剂。
具体工作流程如下：首先，将检测试剂与组织孵育，实现barcode-抗体-靶标蛋白的特异性结合；接着，加入成像试剂，使荧光探针与barcode-抗体-靶标蛋白特异性结合，通过荧光成像分析靶标蛋白的空间分布及相对丰度。成像试剂分批次加入，每次加入3种，成像后在温和条件下洗脱荧光标记物，完成一个检测循环，重复循环直到检测完所有靶标。最终，通过图像处理系统获得单细胞高分辨率蛋白空间分布图。



图5. CODEX工作流程示意图(图片来自Akoya官网)

经典技术如IHC和IF操作简单、成本低，但分辨率和定量能力不足；LCM-MS和IMS提供了更高的分辨率和定量分析能力，但成本高且流程复杂；多靶标成像技术GeoMx DSP和CODEX在高通量和多重检测上具有显著优势，但受制于设备和试剂成本，以及操作复杂度。这些技术各有优缺点，研究者可根据实际需求选择合适的技术进行研究。随着技术的不断改进和整合，未来空间蛋白质组学将在分辨率、通量和适用性方面实现更大的突破，为生物医学研究提供更强有力的支持。

技术发展趋势

随着空间蛋白质组学技术的不断进步，我们正迎来一个全新的生物医学研究时代。为探索癌症及其他重大疾病的分子机制提供了重要工具，并为个性化医疗奠定了技术基础。未来，随着标记技术、成像手段和数据分析能力的进一步提升，空间蛋白质组学有望在分辨率、通量和适用性之间实现更好的平衡，将推动空间蛋白质组学向更高分辨率、更大3D体积的研究迈进。多组学方法的整合为研究提供了互补信息，有助于进一步揭示健康与疾病状态下的分子机制。
未来，随着技术覆盖度和分辨率的提升，研究人员将更深入理解组织环境下细胞的正常功能及异常变化。这将加速精准医学的发展，并为癌症、免疫和神经相关疾病研究提供更多可能。

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参考文献：
[1] “Method of the year,” Nat. Methods, vol. 5, no. 1, p. 1, 2008, doi:10.1038/nmeth1153.
[2] Mund A,Coscia F,Kriston A, et al. Deep Visual Proteomics defines single-cell identity and heterogeneity. Nat Biotechnol. 2022;40 (8):1231-1240. doi:10.1038/s41587-022-01302-5

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