Western blot中为什么要进行封闭这一步骚操作

莺歌燕舞

在做Western blot实验中，会用到固相载体，在这些固相载体表面有很多孔隙（如筛子般孔洞），通过恒流湿转或半干转，凝胶上覆着的蛋白质被转移到膜上，蛋白以机械填补和吸附的方式结合于膜表面。蛋白印记到有很多微米级孔洞的NC膜，但是蛋白并不是连续的，而有很多空隙，抗体也是蛋白，也会被吸附在空的孔，这样就会有很多非特异性的信号。为防止这些位点与抗体结合引起非特异的染色和背景，一般用惰性蛋白质或非离子去污剂封闭膜上的未结合位点来降低抗体的非特异性结合。


封闭剂应该是具有封闭所有未结合位点而不替换膜上的靶蛋白、不结合靶蛋白的表位，也不与抗体或检测试剂有交叉反应的特性。抗原或抗体包被时所用的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在其后的步骤中干扰物质的再吸附。
封闭液中的蛋白能够狠牢固的结合在空白位置上，这样抗体蛋白就不会被非特异性的吸附到膜上，而只会跟特异性蛋白结合。Western的灵敏度某种程度上受限于封闭做的好不好。


Western blot转膜后的封闭液的选择应该根据实验的具体要求和条件来决定，不同的封闭液可能会对实验结果产生不同的影响。除了封闭液的选择，还有一些注意事项会影响Western blot转膜后的封闭效果。首先，封闭液的温度和时间应该根据实验的具体情况来决定。一般来说，低温封闭液可以减少非特异性抗体的形成，但同时也可能会影响特异性抗体的结合。因此，需要根据实验的目的和要求来选择适当的温度和时间。
根据实验的目的和条件，可以选择不同的封闭缓冲液。例如，对于蛋白质表达较低的样品，可以选择含有高浓度封闭试剂的缓冲液，以提高非特异性结合的抑制效果；而对于蛋白质表达较高的样品，可以选择含有低浓度封闭试剂的缓冲液，以避免影响特异性条带的表达。其次，封闭液的pH值也会影响非特异性抗体的形成。一些封闭液的pH值可能不适合某些抗原的保护，因此需要根据实验的具体情况来选择适当的pH值。
除了封闭试剂的选择，封闭步骤的时间和温度也是影响实验结果的重要因素。一般来说，封闭时间不宜过长，以避免非特异性信号的干扰；同时，温度也要适宜，以促进抗原抗体的有效结合。此外，封闭试剂的浓度和膜的清洗次数等因素也会对实验结果产生影响，需要进行适当的调整和优化。一般是将在膜封闭液中4℃下脱色摇床孵育1-2小时左右，封闭孵育后，在TBST缓冲液中冲洗膜3次（每次5min）。


除了提到的脱脂牛奶、BSA、酪蛋白和封闭凝胶溶液，还有一些其他的封闭液也可以用于Western blot转膜后的封闭操作。例如，一些实验室会使用封闭血清，如山羊血清或兔子血清，作为封闭液，它们可以为膜上的抗原提供更好的保护。此外，一些实验室还会使用特定的封闭剂，如抗氧化剂或抑制剂，来减少非特异性抗体的形成。总之，封闭步骤是Western blot实验中不可或缺的重要环节，需要认真遵守实验操作规范，选择合适的封闭试剂和条件，以确保实验结果的准确性和可靠性。
封闭液的质量和纯度也是影响封闭效果的重要因素。如果封闭液的质量和纯度不高，可能会影响非特异性抗体的形成，从而影响实验结果的准确性。



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