怎样用Western blot检测目标蛋白质?

幸福侠侣

琼脂糖凝胶电泳

原文地址：https://www.zhihu.com/question/531808676

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<hr/>1975年，英国生物学家埃德温·萨瑟恩（Edwin Southern）发表了一种可检测和分析整个DNA样本中的一系列DNA片段或DNA序列的方法。这个轰动全球的技术一夜之间让分子生物学实验室的纸巾销量猛增！（别想歪了。。。）
后来，人们以“Southern Blot（萨瑟恩印记法）”来称呼这种技术，Southern来自于埃德温的姓。


Southern Blot在基因发现、定位、进化和诊断研究领域有许多应用。在实际应用中，该技术可用于DNA分析，以检测DNA串行中的突变。它还能够能够检测特定的DNA片段，因此可以进行身份识别，或者帮助法医进行DNA分析。此方法还可用于遗传疾病的诊断等。
不过，它有许多缺陷，比如成本高昂，过程复杂耗时，样品需求量大。因此，该技术大都被聚合酶链式反应（PCR）所取代。
<hr/>斯坦福大学的詹姆斯·阿尔文（James Alwin）、大卫·肯普（David Kemp）和乔治·斯塔克（George Stark）于2年后开发了一种类似的技术来分析RNA。
不知是出于幽默还是想要跟风，当时的分子生物学家们不假思索地把这种方法称为Northern Blot（…并引来了后世的吐槽）。


Northern Blot可用于检测和分析混合RNA样品中的特定RNA分子，从而确定不同基因的活性，也可以用来检测 DNA片段转录的灵敏测试（这些片段将用作SouthernBlot中的探针），还可以检测和定量来自不同组织和不同生物体的特定 mRNA。在医疗上，该方法被用于研究致癌基因的过表达，诊断克隆氏症等疾病，还可以检测在病毒感染中起重要作用的病毒microRNA。
不过和Southern Blot一样，此技术也存在诸多相同缺陷。比如，与RT-PCR和核酸酶保护测定相比，它的灵敏度较低，需要大量的样品RNA，且既耗时又复杂。
<hr/>在1979年，乔治·斯塔克团队，哈里·托宾团队和尼尔·伯内特都先后基于前两种方法发明了用于研究特定蛋白质的印记方法。随后，这种方法便被尼尔·伯内特根据“传统艺能”命名为了“Western Blot”
而关于谁是Western Blot的真正发明人，一直有所争议。


Western Blot是一种具有高灵敏度的极好方法，即使在少量的情况下也能检测特定蛋白质。它已用于不同疾病的临床诊断，比如通过检测血清中的抗 HIV抗体来检测HIV。该技术也被用于在基因表达研究中量化蛋白质和其他基因产物。由于蛋白质印迹法通过蛋白质的大小和与抗体结合的能力来检测蛋白质，因此它适用于评估细胞中的蛋白质表达以及在蛋白质纯化过程中进一步分析蛋白质组分。另外，它还用于分析不同的生物标志物，如生长因子、细胞因子和激素。
不过，由于Western Blot非常敏感，期间的任何不平衡都会影响整个过程的结果。在另一些情况下，由于蛋白质转移不充分，可能不能观察到条带或看到错误条带。其他的一些缺点还包括结果并不总是准确，过程复杂费时且昂贵；只有当蛋白质的一抗可用时，才能对蛋白质进行蛋白质印迹；一些抗体可能通过与样品中的多种蛋白质相互作用而表现出脱靶效应，等等等等
<hr/>作为剩下的唯一可以取名的方向，“Eastern Blot” 已经被大家用来描述许多不同的技术，其中大多数涉及使用不同类型的探针来检测蛋白质的翻译后修饰，例如使用凝集素探测蛋白质印迹膜以寻找特定的碳水化合物。
除了这四种常见的方法，分子生物实验还会用到其他技术。于是，为了延续传统，它们被命名为了Southwestern blots（西南印记法）, Far-Western blots（远西印记法）, Far-Eastern blots （远东印记法）, Middle Eastern blots （中东印记法）等（作为“一切的源头”，萨瑟恩博士看到这些方法的名字可谓是相当无语了…）
<hr/>最后，来一起回顾一下3个blot的内容吧~


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队长是我

Digital WB基本原理及与传统WB的比较

Digital WB(也称Simple Western)技术是传统WB实验技术的高效替代方案。使用该技术，可在同一根毛细管中完成样品分离、捕获、固定、免疫检测和定量分析，从而实现传统WB的所有实验步骤（包括蛋白质上样、分离、免疫印迹、洗涤、检测以及数据分析）自动化，有效提高蛋白质表达定量结果的精确性和重复性。全自动Digital WB技术显著地缩短了样本检测时间到3小时，直接采集化学发光或荧光信号值，利用数字化信号峰面积来表征蛋白含量，短时间内实现了目的蛋白的可视化精准定量分析。
技术特点

Wes全自动蛋白质免疫印迹系统采用革新的Simple Western技术，颠覆30多年传统的Western Blot方法，实现在同一根样品管中完成样品分离、捕获、固定，免疫检测和定量分析。
1、不用制胶和跑胶，不用转膜，减少实验步骤，避免样品损失，避免人工误差的引入，提高结果稳定性。
2、自动进行一抗二抗孵育和化学发光检测，自动进行结果分析，有效提高检测结果的精确性和重复性。
3、单个样品上样体积3-5ul，节约珍贵样品和抗体。
4、检测灵敏度高，低至pg级。
5、实验完成后自动给出详尽的分析数据，包括目的蛋白大小、信噪比、峰面积和含量。
6、可对结果自动进行精确的定量分析。
7、标准实验流程：全程质控数据可溯源，规避孔间/批间操作差异。
实验流程



结果展现




成像图（毛细管实际曝光图）



峰形图（峰面积为化学发光信号值）



泳道图（分子量上大下小）

应用范围

可自动进行各种蛋白质样品分离、免疫检测、定性和定量分析，广泛应用于蛋白质性质鉴定、蛋白质定量分析、蛋白质功能研究、蛋白质修饰和表达差异研究、抗体研究等多个领域。
优势应用领域：
1. 低丰度样本：如外泌体、膜蛋白等
2. 珍贵实验材料：如干细胞，流式分选细胞等
3. 来源受限样本：临床组织切片等
样品要求

1、样品的制备方法与传统Western相同：样品保存在裂解液(Lysis Buffer)中, 某些裂解液成分可能会对实验结果有影响。不要加入Western上样缓冲液(Loading buffer)。
2、通过BCA试剂盒测定蛋白质浓度。
3、送样浓度建议在3 μg/μL或以上，如果靶蛋白丰度低(如磷酸化蛋白)，推荐上样终浓度2 μg/μL，其他靶蛋白可选择 0.5 μg/μL。
4、测定浓度后，样品可分装冻存在-80 ℃冰箱，干冰邮寄。
应用案例

珍贵实验材料

干细胞、流式分选少量细胞等



样本来源：临床分选得到的骨髓干细胞
检测用量：2500个骨髓干细胞
文献来源：The impact of integrin β2 on granulocyte/macrophage progenitor proliferation. STEM CELLS. 2018


低丰度蛋白

外泌体、膜蛋白等



样本来源：M1 样巨噬细胞衍生的细胞外囊泡 (M1EVs)
检测用量：~0.5ug总蛋白（上样浓度约0.1ug/ul）
文献来源：Exploration and functionalization of M1-macrophage extracellular vesicles for effective accumulation in glioblastoma and strong synergistic therapeutic effects. Signal Transduction and Targeted Therapy 2022


样本来源：细胞膜紧密连接蛋白claudin-5（干燥症）
检测用量：~0.1ug总蛋白（上样浓度约0.02ug/ul）
文献来源：Disruption of endothelial barrier function is linked with hyposecretion and lymphocytic infiltration in salivary glands of Sjögren‘s syndrome. Molecular Basis of Disease. 2018


来源受限样本

临床样本、生殖细胞等



样本来源：临床心衰病人心肌内膜活检样本
HFrEF样本取自原位心脏移植前扩张性衰竭心脏的右室间隔；
对照样本取自未衰竭、移植的、未使用的供体心脏的右室间隔。
文献来源：Nitrosative stress drives heart failure with preserved ejection fraction. Nature, 2019




样本来源：小鼠2-cell胚胎
检测用量：132个2-cell胚胎用于检测3个靶蛋白（7ul 裂解物）
文献来源：Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic-transition. Nature
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检验医师

我们都知道，电荷在电场中会受到一定大小的力，因而，带电荷的物质在电场中也会受到相应力的作用，甚至克服各种阻力产生运动。蛋白质也不例外，其同时带可解离出H+使其本身带上负电荷的酸性基团羧基以及可以结合H+而使其本身带上正电荷的碱性基团氨基，只要这两者不达到平衡（即蛋白质的等电点，调节溶液PH，使蛋白质羧基与氨基解离及结合的H+量相等，从而使蛋白质本身正负电荷达到平衡，净电荷为零），蛋白质就会带上一定的电荷，从而受到对应电场力的作用。


       在一电场下，电场力F=Eq（E为场强，q为电荷量），即就蛋白质分子来说，在同一电场下，E固定不变，其受到的电场力与其本身所带的电荷成正比，若电场力足够大，能够使蛋白质分子产生运动，其运动的速度一方面与电场力（即动力有关），另一方面，也与其受到的阻力有关，而阻力的大小主要是由蛋白质的形状以及分子量决定的（介质性质一定的条件下）。在带电荷量、蛋白质形状以及分子量综合影响下，施加一定时间的电压后，具有不同运动速度的蛋白质由于运动的距离不同而分开。但仅就此来看，由于具有以上三个可变影响因素，我们并不能完全确定运动到同一位置的蛋白质为同一种蛋白质。
       而在这三个影响因素中，对于蛋白质的识别最具特异性的，必定是蛋白质的分子量了，恰好这一影响因素不可被人为因素控制，而前两者较易受环境因素的影响，因此比较好的解决办法便是寻找到一种条件，能够使所有蛋白质分子所带的电荷量以及分子形状都相等，从而使蛋白质分子前行的距离仅受蛋白质分子量的影响，帮助我们得到更加纯净的蛋白质分子。因而现在又发展出了往介质中加入十二烷基硫酸钠（Sodium dodecyl sulfate，SDS）等阴离子去污剂以及二硫苏糖醇（Dithiothreitol，DTT）、巯基乙醇等强还原剂使蛋白质完全变性后再施加电压的方法，前者可简单打开蛋白质分子内部以及蛋白质分之间或蛋白质分子与其他分子之间的氢键、疏水键等非共价键并与蛋白质结合，使所有蛋白质分子都带上大量负电荷，掩盖原有电荷对运动速度的影响；而后者还可进一步打开蛋白质分子半胱氨酸残基的二硫键，使所有蛋白质都呈均一的线性结构，排除蛋白质分子形状不同对运动速度的影响。以上即广为当今科研人员使用的电泳分离获取目标蛋白的原理，依据是否加入能使蛋白质分子变性的阴离子去垢剂以及强还原剂将其分为变性电泳和非变性电泳。依据电泳介质的不同又分为聚丙烯酸酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）、琼脂糖凝胶电泳以及等电聚焦电泳等等，不同的介质适于电泳分离的蛋白质、核酸种类也不尽相同，可根据实验的实际情况依研究对象以及研究目的来具体选择。
       蛋白质印迹（Western Blotting，WB）即是依托于电泳技术分离出蛋白质并对其进行半定量甚至定量分析的一种方法。同样的DNA以及RNA也可带上一定电荷，由此发展而来的DNA印迹（Southern blotting）和RNA（Northern blotting）印迹也可利用相似的方法分离出DNA、RNA并进行定量分析。下面以WB为例，对其进行详细介绍：
       从总蛋白中分离出我们想要的蛋白质，首先我们要从实验对象（可以是细胞或动物组织等）中提取出总的蛋白质，即进行蛋白质的提取。
      需要注意的是，无论通过组织还是细胞提取蛋白质，所有操作都需要尽量控制在低温环境，以尽量降低蛋白酶活性，减少蛋白质的降解。
若是从组织中提取：
① 事先预冷研磨仪的适配器，并按估计的样品管质量准备好研磨时所需的配平管，或者是准备好冰块，以备组织于冰上用研磨棒研磨；
② 获取组织后须立即加入适量配置好的裂解液【RIPA裂解液：蛋白酶抑制剂/苯甲基磺酰氟（phenyl methane sulfonyl fluoride，PMSF）：磷酸酶抑制剂（若后续需要进行磷酸化实验，必须加入，反之，可不加）】，具体用量以及配置比例等可参考试剂说明书；
③ 将样品管和配平管连同预冷好的适配器，安装入研磨仪，加入研磨珠，按仪器对应的操作说明，设置好参数，开始研磨；
④ 研磨好的样品置于4℃下放置30min（具体时间可根据说明书调整），期间涡旋震荡数次，使试剂充分混匀，反应充分；在此期间，可提前十分钟左右预冷离心机至4℃（根据不同仪器所需的预冷时间而定）；
⑤ 4℃、12000rpm离心10分钟；离心结束的前几分钟，可先从-20℃下取出蛋白质上样缓冲液（protein loading buffer），放置于4℃环境，冷却至液体状态；
⑥ 取上清加入有旋钮的蛋白管，离心管为扣盖式，后续加热温度过高可能会使扣盖弹开，污染蛋白甚至热水射出烫伤；加的时候注意上清体积，加完后按蛋白质上清：蛋白质上样缓冲液=50：1迅速加入蛋白质上样缓冲液（具体比例也可参考说明书）；
⑦ 蛋白管沸水煮5-10分钟至蛋白质变性；
⑧待蛋白冷却后放入-20摄氏度或者是-80摄氏度冰箱中冷冻保存，若蛋白量比较大，可分装保存，一次取一管，避免反复冻融；
       接下来让我们以目前最常用的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）了解一下的电泳的详细过程以及注意事项：
① 制胶：分为浓缩胶以及分离胶，不同品牌的制胶原料会有些许差异，可依据相应试剂的说明书进行制备。特别需要注意的是其中过硫酸铵（Ammonium persulfate，AP）和四甲基乙二胺（N,N,N,N’-Tetramethylethylenediamine，TEMED）均为胶凝固的催化剂，可以选择先把其他原料加好之后，准备将胶注入玻璃板内时，再将其加入，防止胶过快凝固，AP加入数小时后，将导致TEMED一加入制胶液中，即使胶凝固，难以加入玻璃板内。另外，AP遇光易分解，最好现配使用，使用完之后4℃避光保存；TEMED具有神经毒性，实验过程中佩戴口罩，最好在通风厨下操作，避免吸入过多，损害身体健康，同理，制好的胶因含有TEMED，而具有一定的神经毒性，使用完后妥善处理，避免皮肤直接接触。
② 准备密闭性良好的玻璃板：制备一块胶需要事先准备清洗干净无边角缺损的一大一小两块玻璃板作为载体，将小玻璃板与大玻璃板带有突起磨砂侧边缘对齐叠放，一起放入垂直槽制胶架，并置于水平实验台上，轻压大、小玻璃板顶部，使两者底部平齐，接着夹紧两侧架子之后，将垂直槽制胶架固定于垂直槽制胶固定架中。向两块玻璃板的缝隙内注满超纯水，通过观察几分钟后液面是否下移，若下移，则需要将装置拆卸重新组装或者是更换玻璃板、制胶架等，直到不再漏水为止；若不下移，则可直接进行下一步操作——将玻璃板内的水倒掉，并倾斜用滤纸吸干剩余的水分。





③注分离胶及液封：紧接着第①步，将分离胶未加入的原料AP以及TEMED加入，再用移液枪缓慢注入玻璃板间隙内，最好是顶着玻璃板两侧的角落注射，此位置液体与空气的接触面积最小，液体可沿着周围的玻璃板壁下移，最大程度减少气泡产生。若已经产生气泡，由于气泡的密度低于分离胶溶液，气泡将浮于溶液表面，此时可将玻璃板轻轻左右晃动，大部分气泡可撞破消失，剩余的少量气泡会趋向于移向玻璃板的两侧，可在加完足量分离胶溶液后倾斜玻璃板，使边缘的气泡浮于玻璃板的表面，再用吸水纸吸除。确保分离胶液体表面无气泡后，再用枪头注射入适量超纯水或者无水乙醇液封，一方面其可以防止空气进入分离胶内，在分离胶内部形成气泡，另一方面，液封液体还可以起到压缩堆积作用，加速加速胶的凝固的同时，还在分离胶浓度高于浓缩胶基础上，进一步缩小分离胶孔径的大小，增大蛋白质移动至浓缩胶和分离胶分界面时的阻力，降低蛋白质于分界面处的移动速度，并且使分离胶表面光滑平整，易于蛋白质在此处不断压缩形成一条条狭窄的等高蛋白区带，从而使蛋白质在分离胶中运动的起始线趋于一致、分子量相等的蛋白质趋于运动至同一蛋白条带内，减少条带蛋白的扩散。静置至液封液体和分离胶交界处出现一条明显的折光线时，就说明分离胶已经凝固了。



亦可以通过观察未加入玻璃板内的管内剩余分离胶是否凝固加以判断，若凝固，则玻璃板内亦凝固；反之，未凝固。在分离胶凝固前可事先清洗并烘干梳子，准备好浓缩胶同样未加的试剂AP、TEMED以及加样所需枪头等器材。
④ 注入浓缩胶溶液：分离胶凝固后，倾斜玻璃板倒除液封溶液，并用滤纸吸干残余液体，同样方法缓慢注入浓缩胶溶液，并立即垂直插入清洁干燥的合适梳子，等待胶凝固即可。
⑤加样以及电泳：浓缩胶凝固后，卸去玻璃板周围的制胶架、固定架，将玻璃板转移至电源槽内，注意小玻璃板的两侧顶部需要卡在电源槽的特定部位，若仅制作一块胶，对侧可用具有同样结构的塑料板代替，并按同样的方法装入，如图所示：


电源槽装好后放入电泳槽，先将电泳液加满电源槽，通过判断几分钟内液面是否下降来确定电源槽和玻璃板组装的密闭性，若液面不下降，则密闭性良好，可继续实验，反之，则必须重装，直到不漏液为止。若漏液，导致电源槽内电泳缓冲液表面不平整、不同样品蛋白条带对应部位电压不同、蛋白条带跑歪、失去可比性并影响判断的准确性。电源槽内的电泳缓冲液必须加满，可直接将所有电泳液均加入电源槽，通过其溢出加入电泳槽内，一般电源槽上会标明电源槽内所需加的电泳液量，两块胶加至电泳槽的1/2左右，四块胶则需接近加满，按胶的比例加入即可。


加完电泳液后，按照红对红、黑对黑插入电极，打开电源，设置参数，起初，电压可低一点（如70V左右），待蛋白缓慢跑至浓缩胶与分离胶的交界处压缩成一狭窄的蛋白区带后，再转为高电压（为保证蛋白均被压缩，低电压时间可长一点，待所有蛋白条带均进入分离胶后，再转为高电压，低电压有利于浓缩胶对蛋白的压缩，对于分离胶内蛋白而言，仅影响其分离速度，所以为提高实验的准确性，宁愿低电压跑胶的时间长点比较好）。但平时为方便起见，时间一般设置为30min左右，看到红色条带出现即可。增大电压（如230V左右），加快跑胶速度，以更快获取所需的蛋白条带（Marker中跑出目的蛋白分子量所在蛋白条带区间即可，可不用跑出所有条带，但也应尽量避免跑胶时间过短，Marker条带间隔过短，影响判断和估计准确性；或者是跑胶时间过长，条带跑至胶底部，导致所需的蛋白条带重叠于胶底部）。跑胶完毕后，如图，可将Marker不同蛋白条带与给定的说明书对比，推测其分子量：


⑥转膜：注意转膜过程中需要全程保持胶和膜的湿润，但需注意的是胶不可接触高浓度甲醇，否则蛋白易与SDS分离、凝固，导致转膜不充分或完全检测不到所需蛋白，可在胶上倒满电转液之后放上膜
使用合适的板子将小玻璃板小心撬下，动作切忌过猛过快，防止小玻璃板碎裂，撬下玻璃板后立即在胶上倒满电转液，防止膜干，切除浓缩胶以及不含蛋白的边角部分，
再小心将剩余胶从板子上分离，置于“三明治”结构靠近黑塑料板的滤纸上，重新于胶上倒满电转液。接着根据目标蛋白所在区间大小剪裁合适大小的膜，【聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride membrane，PVDF膜）需先于甲醇中浸泡2-3min激活后方可使用，而硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，NC膜)则无需激活，只需用缓冲液湿润即可】，在特定部位做好标记后置于目标蛋白所在胶面上。
我们常听说过一句话“胶没有正反，膜有正反”，这句话是什么意思呢？
前者的意思为无论胶的哪一面与膜接触，胶上的蛋白都将平行的转移到膜上。而膜有正反主要是由转膜后进行膜曝光时必须将与胶直接接触的一面（即蛋白面）朝上放置决定的（转膜前膜也是没有正反的，哪一面与膜接触均可），因此，我们标记的关键便是要利于我们区分哪一面为蛋白面，如下图所示，在左上角剪一小角，曝光时将小角翻转至右上角即可（但不能是偶数边的正多边形，比如正方形，其实验者能记得膜初始放置的大概方位），除此方法外，我们还可在我们确定的某一面写上非镜面对称的字（如数字2）等方法来区分；此外辨别膜的正反，还有助于我们根据膜在胶上的位置来确定曝光的蛋白条带所对应的蛋白样品。


同时，这里需要注意，夹膜最好用钝头镊子，减小镊子与膜接触面压强，从而减轻镊子对膜以及后续转膜后夹膜时对膜上蛋白质的损伤；同时降低膜皱褶产生的可能，若膜产生了皱褶，曝光时膜难以放平，皱褶下间隙内的气泡难以排尽，曝光后拍摄的图像上会看到与气泡一致的杂影。


排尽滤纸、胶以及膜各层接触面之间的气泡，以减少气泡内气体对带电荷蛋白质分子移动的阻碍，夹紧“三明治”结构，按“红对透明，黑对黑”放入电转槽中，加入电转液，电转液的量需没过对应膜的顶端。


再按“红对红，黑对黑”插入电极，再将整个装置浸泡于冰水混合物中，以防止电转释放的大量热量将膜烤焦，


最后设置电流以及转膜时间等参数即可。具体的转膜电流以及时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜电流越大、时间越长，反之，则所需的转膜电流越小、时间越短。一般电流选择250mA左右，转膜时间80min左右（可根据实际情况不断调整改变，找到最佳条件）。
⑦ 封闭以及孵育一抗、二抗：转膜完成后，取出膜，，于摇床上Tween 20 去垢剂的 Tris 盐缓冲液（Tris Buffered Saline with Tween 20， TBST）清洗三次，每次5分钟（清洗干净即可）；清洗完成后，蛋白面朝下，放入配好的封闭液中，常用的封闭液有5%的脱脂奶粉以及其他新型快速封闭液等，前者往往需室温封闭数小时（约1～2h），而后者数十分钟即可，封闭完成后回收封闭液，按转膜完成后的清洗方法再次洗干净，放入配置好的对应种属的目标蛋白抗体中，4摄氏度孵育过夜（约16～20h）或者室温赋予1～3h；孵育完成后回收一抗，按同样的清洗方法将膜洗干净，换配置好的二抗，室温孵育1～2h，孵育好之后，回收二抗，再次将膜清洗干净即完成。
注意：以上提到的相关时间仅是大概，具体需要结合说明书以及当下的实验条件优化调整，建议每日记录下做实验所用试剂配比大小、环境温度以及清洗、封闭、孵育时间等，根据结果，寻找可能存在的不足并加以改正，如此方可不断进步；若是新手一定要注意，一抗、二抗的回收，不要实验完顺手就到了，因为这两样试剂还是比较贵的，尤其是一抗；孵育一抗时也可尽量选择4摄氏度冰箱过夜孵育，以减少抗体的损失，增加可回收利用次数）
⑧ 曝光：常用化学发光法，依据膜的面积大小，约0.1ml/cm²，按A液：B液约1:1的比例尽量遮光条件下配置好发光液，可选用棕色遮光的离心管盛装并混匀后，暗处静置数分钟。此时，可先将膜蛋白朝上放置于曝光仪器的抽屉中拍摄Marker，此时需打开旁边的发光灯，一般拍摄之后选择保存并自动叠加；接着再次打开抽屉，均匀滴上发光液，常规选择自动曝光，等待数分钟后即可看到结果，一般曝光时间越久，背景会越深，可根据结果手动调整曝光时间（当然，还是一句话，试剂的具体用法用量、仪器的操作规范还是以对应说明书为准）。