产品解析 | 分子POCT产品之BioFire FilmArray

风云

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前言
微流控学习的往期文章写过很多关于分子POCT产品的，目前国内市场上分子POCT产品主要分为几个大类，即片式、盒式和囊式，其中片式的产品结构上相对要简单点，可大概分为直线形（我们暂且把单一管式的那种也算在这一类）、扇形、圆盘形等；盒式的分为圆筒式、卡带式、孔板式等；囊式分为储液囊+圆盘、储液囊+卡盒、薄膜式等。今天我们说的这款产品BioFire Diagnostics FilmArray是囊式分子POCT的技术领先产品，也是目前囊式分子POCT的主流技术实现方式，下面本篇正文小钱将为大家学习和分析这款产品。


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2. BioFire公司发展历程




图来源：[1]
小结：BioFire的原始团队历经二十多年的创业发展，几乎两年就有新的产品上市，基于PCR的底层技术做创新（巢式PCR技术），开创了HRM高分辨率熔解曲线分析技术和其独特的微流控技术，使其公司的发展曲线持续向上，转折点主要有2011年其产品FilmArray获得FDA（从科研走向临床）、2014年公司被生物梅里埃收购（成为巨头生物公司的子公司）、2022年其FilmArray试剂盒产品获得NMPA（进入中国临床检测市场）。


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3. FilmArray
3.1FilmArray国内注册证的产品
拜奥法尔诊断有限责任公司BioFire Diagnostics, LLC
1）全自动医用PCR分析系统FilmArray 2.0
•国械注进20163222753
•结构及组成/主要组成成分：该产品主要由主机（反应流控制系统，温度控制系统，光学系统，数据采集传输系统）和软件组成。
•适用范围/预期用途：该产品与特定试剂盒配套使用，可对人体来源临床样本中多种病原体的核酸靶序列进行检测。



2）脑炎/脑膜炎多重病原体核酸联合检测试剂盒(封闭巢式多重PCR熔解曲线法)FilmArray Meningitis/Encephalitis (ME) Panel
•国械注进20223400387
•结构及组成/主要组成成分：包含FilmArray ME 测试条、样本缓冲液、溶解液，还包含一次性使用红色样本注射管和独立包装移液管。
•适用范围/预期用途：该产品用于体外定性检测具有脑膜炎及/或脑炎体征及/或症状的人群的脑脊液 (CSF)样本中的 14 种细菌、病毒和隐球菌的核酸。包括：大肠埃希菌 K1 株、流感嗜血杆菌、单核细胞增生李斯特菌、脑膜炎奈瑟菌（有荚膜）、无乳链球菌、肺炎链球菌；巨细胞病毒、肠道病毒、单纯疱疹病毒1 型、单纯疱疹病毒2 型、人疱疹病毒6 型、人双埃可病毒、水痘-带状疱疹病毒；新型隐球菌（新生/格特）。



3.2FilmArray产品介绍
BIOFIRE®FILMARRAY®测试只需要两分钟的手工操作时间，上机运行时间具体根据测试不同大约需要45到75分钟[3]。
BIOFIRE®FILMARRAY®系列拥有市场上最全面的传染病病原体菜单，包括：
BIOFIRE®FILMARRAY®脑膜炎/脑炎（ME）感染测试，直接从脑脊液中鉴定14种脑膜炎和脑炎的细菌、病毒和真菌病原[3]。
BIOFIRE®FILMARRAY®呼吸道感染测试（RP2和RP2plus），直接从鼻咽拭子转运培养基中鉴定21-22种呼吸道病毒和细菌，包含甲乙型流感病毒，4-5种冠状病毒在内的17-18种常见呼吸道病毒以及4种非典型病原体[3]。
BIOFIRE®FILMARRAY®肺部感染（PN）和肺部感染加强版（PNplus）测试，从痰（包括气管内抽吸物）和支气管肺泡灌洗液（包括mini-BAL）中鉴定33至34个靶标（涵盖18种细菌、8至9种病毒、7种抗生素耐药基因）。其中15种细菌靶标，可以提供样品中病原体丰度的半定量结果信息[3]。
BIOFIRE®FILMARRAY®血流感染（BCID）测试，直接从阳性血液培养中鉴定27种最常见的血流感染病原和相关的抗生素耐药基因[3]。
BIOFIRE®FILMARRAY®胃肠道（GI）感染测试，从Cary Blair培养基保存的粪便中鉴定引起感染性腹泻的22种最常见的病毒、细菌和寄生虫[3]。
小结：FilmArray的检测菜单分为6个大类：呼吸道感染22联检；血液感染43联检；消化道感染22联检；脑膜炎/脑炎14联检；肺炎33联检；关节感染39联检。其主要解决的是危急重症感染对于快速病原体诊断的需求。FilmArray通过多腔室超多重检测的设计，能有效提高危急重症感染的病原体检出率，缩短病原体检出时间，从而缩短患者ICU住院天数，有效减少了抗生素的滥用。在某些情况下，甚至能挽救患者的生命[2]。
3.3FilmArray产品销售情况



图：FilmArray®是多重PCR分子诊断系统检测流程
截至2016底，FilmArray的装机量是4000台，对应的销售额2.6亿美元[1]。截至2019年9月，全球安装的BIOFIRE®FILMARRAY®系统数量约为9800台[3]。


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4. FilmArray产品解析
4.1 微流控技术
虽然FilmArray芯片功能复杂，但整个FilmArray芯片可以简单分为两个部分，上面的储液管组和下面的反应层（由于其本质为具有多个密封泡的柔性塑料故命名为柔性袋）。其基本结构如下图所示[4：公众号 科技老丁哥]。



图：测试芯片由储液管组和柔性袋结构垂直塑封组成。
注意这两个部分并不是重叠排列，而是相互垂直排列，即将储液管组通过热塑封垂直封接到下部分的柔性袋。其结构类似于将离心管并排（储液管组）竖立粘接在一张水平放置的白纸上（柔性袋）[4]。
1）储液管组的基本结构
储液管组是由12个具有特殊结构的储液管并列而成，该储液管的材质为PP，或其他具有一定机械强度的材料，能够在内部真空的条件下不会发生明显变形。储液管内部被抽成真空，便于内部固体试剂的长期保存和测试时液体试剂的吸入。每个储液管内部预装有不同的冻干试剂，所以实际上内部储存的并非“液体”，而是“固体”。在储液管组两端分别有样品入口和稀释液入口，用于加样。如下图为了观察方便使用红色或蓝色液体填充储液管[4]。



如图，从图中左到右的顺序，各储液管中冻干试剂分别为：
1，过程对照材料（即裂殖酵母细胞，测试时同样经过细胞裂解，核酸提纯，巢式PCR，如果检测为阳性，说明仪器操作和化学过程正常，否则报错，不给出检测结果。）
2,-5, 清洗液，核酸纯化用。
6，核酸洗脱液
7，逆转录/PCR-I反应液
8，稀释液
9,10，PCR-II反应液，含LCGreenplus+荧光染料
11，空，或稀释液？反应液？
12，空，用于收集PCR-II反应溢流液[4]
2）柔性袋的基本结构
下层的柔性袋在功能上主要包括四个部分：细胞裂解区，核酸纯化区，第一扩增区，第二扩增区。各个部分的具体结构样式并非固定，只要能实现各自的功能，也可以采用其他结构。如下所示为专利US8409508中公开的柔性袋的一种结构示意图[4]。



图：一种柔性袋的内部结构说明
该柔性袋结构的材质是透明的涤纶/PP材料（或其他透明的柔性的薄的材质），其制备方法是将一层薄膜对折，然后使用热塑封的方式将不同位置加热密封，以此形成具有不同大小袋状的结构，这些结构分别构成了该测试芯片的基本功能单元[4]：
细胞裂解区：用于样品中病原菌或病毒的裂解，使其释放内部核酸物质。
核酸纯化区：对核酸物质进行提取和纯化。
第一扩增区：纯化后的mRNA反转录或/和DNA进行第一步PCR反应。
第二扩增区：第一PCR反应完成后的扩增子在稀释后在第二扩增区发生扩增，同时高温裂解，获取每个微池中PCR-II扩增子的裂解曲线[4]。



图：柔性袋内部不同区域功能说明。
在柔性袋密封之前，三种不同试剂被预装到不同结构单元的不同位置，这三种试剂分别是：在细胞裂解池中预装有陶瓷微珠；在DNA纯化池中预装有冻干的硅胶磁珠；在第一PCR池中预装有第一PCR所需要的多种引物。如图上中所示[4]：
第二扩增区并非在柔性袋中通过热塑封的方式制备，而是另外一种材料制备的特殊结构，通过粘贴的方式贴合到柔性袋上。第二扩增区是由黑色的0.5mm厚PC材料制成，包括有102个微池，每个微池的体积为1uL。从下图可以看出该PCR-II反应池的基本结构及其内部预装的PCR-II所需引物[4]。
4.2 巢式PCR
巢式PCR（nest PCR）是一种变异的聚合酶链反应，是Mullis（1987）在常规PCR基础上建立的，他使用两对PCR引物对进行两轮PCR扩增反应获得完整的片段。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片段，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异。解决了常规PCR扩增技术应用一对引物扩增目的基因片段、灵敏度和特异性有时达不到实验者的要求的问题[5]。
技术原理：PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料、靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4min，2～3h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。而巢式PCR是通过两轮PCR反应，使用两套引物扩增特异性的DNA片段。第二对引物的功能是特异性的扩增位于首轮PCR产物内的一段DNA片段。第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增，从而提高反应的特异性[5]。
4.3 HRM高分辨率熔解曲线分析
高分辨率熔解曲线(high-resolution melting，HRM)是一种基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分析新技术，具有极高的敏感性，可以检测出单个碱基的差异。作为一种高效稳健的"post－PCR"技术，它不受突变碱基位置与类型的限制，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解即可完成对样品的分析。HRM技术因操作简便快捷、成本低廉、结果准确，并且实现了真正的闭管操作而受到普遍关注[6]。
HRM原理：在PCR反应前将新型DNA饱和荧光染料加入反应体系，然后将PCR产物直接导入高分辨熔解分析仪中，在一定的温度范围内将PCR扩增产物进行加热变性，仪器的光学检测系统采集、分析荧光信号并绘制温度熔解曲线，根据不同熔解曲线形状来区分（单个）碱基差异。最广泛的 HRM 分析应用领域是基因筛查。基因筛查是搜索 PCR 扩增片段中是否存在未知变异，它可在测序步骤之前进行或者作为替代测序方法。由于 PCR 产物突变可导致 DNA 熔解曲线的形状改变，因此它可以利用 HRM分析检测。杂交双链 DNA 样本扩增并熔解时，其熔解曲线不同于纯合野生型或突变样本。如果操作得当，可以减少至少95%的测序工作量。随着DNA染料和分析仪器的发展，HRM技术还将继续完善和改进，在遗传病分子诊断领域发挥更多的作用[6]。
美国Idaho 公司生产的第一种专门应用于HRM 的检测仪HR-1，其主要用于基因预编筛查和SNP分析分型。
4.4 产品技术优势
4.4.1囊式的微流控方式
FilmArray采用一种全新的气动囊泡结构来驱动流体和软囊袋材料作为反应载台。
和市场上目前已经有的微流控产品的不一样，像博奥的分子圆盘也有储液囊，还有像abaxis的生化圆盘也有储液囊等，但是这些囊只是起到一个储存液体的作用，即将以前我们需要二次加样的试剂，预先存储在囊袋中，利用芯片和微流控设备的机械配合，一次性将囊袋内的试剂做释放，这种囊的作用主要就是存和放的作用，但是像FilmArray微流控产品是真正将囊这种软袋材质用作微流控的反应载台，同时利用微流控设备驱动另一套囊泡袋结构来配合施压驱动，这种方式至今国内还没有出现类似技术的上市产品，而这种微流控产品的材料成本是很低的，就有点像以前用薄膜做微流控产品，相比较热塑性注塑成型的材料有着显著的成本优势。
4.4.2 制造工艺上的创新
储液管组的封装制备工艺：储液管组是采用注塑成型的方式获取单个储液管的各个组件，比如活塞，固定卡等。然后在真空环境中将这些组件安装在一起[4]。
在所有预装液体试剂都装载到储液管中后，在储液管顶部插入活塞，为了使储液管中真空腔固定，在活塞处插入固定卡，然后将整个储液管组放置到低压冻干仪中，在冻干过程结束后，原先的液体试剂也就变成了固体存储在特定储液管中，同时由于储液管组仍然处于真空环境，储液管内部腔室也被抽成真空状态，然后将储液管中真空口密封[4]。
储液管封装完成之后就会和制备完成的柔性袋结构封合在一起，此时就需要通过热塑封的方式，将储液管底部封合到柔性袋上端开口处，使得储液管与下方柔性袋各反应池的结构一一对应。如下图可以看出储液管和柔性袋的封装过程[4]。



图：FilmArray测试芯片的封装方法示意图[4]。
4.4.3 仪器的微流体控制系统
FilmArray仪器内部具有和FilmArray测试芯片中柔性袋各反应池一一对应的囊泡结构，可以想象，对某些囊泡进行充气，则囊泡会挤压柔性袋特定部位，从而使得该部位的液体流向其他未挤压部位，同理，如果对某个关键通道处进行充气挤压，则会完全封闭该液体通道，放气则会使得通道打开，如此便形成了该柔性袋中的挤压阀。这种囊泡结构的气动挤压促使液体均匀可控的朝向下一个反应池运动，同时由于挤压阀的存在，液体在柔性袋中的流动方向和流动体积则变得完全可控[4]。
下图是仪器中与柔性袋对应的囊泡结构，通过对这些囊泡结构的充气和放气，便可以控制液体在各反应池中运动，完成例如细胞裂解，核酸纯化，巢式PCR扩增等基本反应[4]。



图：FilmArray仪器中用于挤压柔性袋的囊状结构示意图[4]。
下图是FilmArray测试仪器的内部结构图，可以看出，整个仪器都是使用压缩气体来驱动的，而压缩气体上的阀门，以及哪一个部位应该充气或放气，则是由电脑程序来精确控制。



图：FilmArray检测仪器内部结构图[4]。


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5. 为何国内学习FilmArray的产品远比学习赛沛Xpert产品的少??
国内微流控产品的商业化进程要比国外产品商业化可能要晚十五左右，像FilmArray这款产品早在2003年就已经申请专利了，而赛沛的Xpert微流控产品专利也很早，Cepheid公司在2000年就有这种卡盒的专利申请记录。而国内在学习赛沛Xpert这种卡盒产品方向上做商业化产品的公司还是多的，原因主要有两点，国内的注塑工艺比国外更“效率”，其产品设计也更“效率”，赛沛的产品一开始不追求很多重，主打就是一个样本进结果出（回到分子检测上的需求上，就是密闭性的组装工艺），让POCT产品替代传统的PCR实验流程，而其产品的结构也并不复杂（相对于国内已经在走下坡路的3C产品设计），对于国内做仪器设计的工程师（国内微流控工程师由仪器工程师转型的偏多），认真学习一周，就能仿着将其产品设计出来，再到如何设计出避开“抄袭”而被诟病的情况，这时候一般都是老板或专业的微流控科研工程师亲自指导，快的话一周再设计一版“非抄”版也不是难事，甚至有的产品还能根据国内院端客户或个别试剂盒项目做更好的优化设计（如果不是医疗器械注册的限制因数，一款类赛沛产品的开发周期，快的话可能只需要3个月就出产品了，小钱指的是3个月就可以拿出去做非临床端的应用了）。回顾国内出现这么多“类Xpert”的产品的主要还是归功于中国制造的效率，以及中国工程师的勤奋（这点有点类似国内汽车、手机电脑、家电等产品的发展规律，先拿来再创新，无可厚非）。
回到本文的主角产品FilmArray，为何国内类FilmArray的产品很少，这点我们可以参考上段小钱分析类赛沛产品发展快的思路而定，赛沛的产品大家学习的多，原因是设计门槛和工艺门槛其实并不高，微流控卡盒和3C产品比较，其设计难度根本不在一个难度级别（我指的是非流体和应用层面的设计，因为这种设计目前国内能胜任的工程师其实不多，一般都是做科研的人负责或很资深的微流控从业者），但是FilmArray和赛沛产品有很大区别，这款产品颠覆了一个普通仪器工程师对IVD设备开发的认知，这款产品从立项开始定位就是一款偏高端的POCT产品，其超多重、囊式的微流体、液体试剂存储、全密闭键合工艺的特点都是开发分子POCT产品种很难实现的点，今天我们看的分子微流控产品多了后，可能认为它并不难，但是在10年前的时候，这种产品我们想看明白都有难度，别说学习FilmArray再创新制造一款新的产品了。
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参考
[1] 医业观察 https://mp.weixin.qq.com/s/iqcweM-QKJfZvIuAlT9bhw

[2] 晓霞说IVD https://mp.weixin.qq.com/s/lay8SJIvVyDBcXyFT6z3_g
[3]生物梅里埃 https://mp.weixin.qq.com/s/XJ9s-mwo9endxvScQOTtsA
[4] 科技老丁哥-FilmArray微流控芯片解密 系列文章
[5]《食品安全快速检测与预警》孙远明等编著
[6] LAB-BIOGEN倍捷科技 https://mp.weixin.qq.com/s/1Cs-6P6PLMCO_tKLNRwBLA
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