光学显微镜的空间和时间分辨率极限是多少？

幸福侠侣

光学显微镜的空间和时间分辨率极限是多少？
原文地址：https://www.zhihu.com/question/533462660

继续前进

这是俩独立问题。
时间分辨率那里还有一堆半独立的参数，拍摄重复率啦，扫描模式啦什么的，少年,先学习，再发问，专业问题尽量问身边的人。

大力水手

Microscopy Series 8： Resolution（分辨率）。Jeff专门出了一个视频讲分辨率，从拍摄斑马条纹开始讲起，如何采集信息才能获得物体最细微的特征。所以我也单独写成一篇，以示其重要性。
首先以拍摄斑马条纹开始（假定成像在一张大小确定的照片上）。当分辨率极其低时，照片一共只由几个像素块组成，每个像素块都是一大片信息的综合体，比如头和脖子被整合成一个像素块，所以连是什么动物都看不出来，完全失真。
随着逐渐增加分辨率，也就是组成照片的像素块越来越小，像素个数越来越多，每一个像素块变成了像素点，其包含的信息也就来自于原始斑马中更小的一个面积，也就更加能够体现原始的信息。在这时候，不仅是斑马躯干的大条纹越来越清楚，连头部的细条纹也都越来越清楚，但有很多更加细小的条纹，由于像素采集过程中被整合在一起，所以出现了“横向”条纹---这是失真的一种表现。
最后像素点极小，照片包含了巨大数目的像素点，连斑马头部另一侧的竖条纹都能够看得一清二楚。图片完全还原了斑马的真实信息。
由此提出了分辨率的概念：对于两个点进行拍摄，距离远时很容易拍成两个点，但随着两个点距离变小（就像斑马的头部细条纹），总有某个距离是会出现两个点被“拍摄整合”为一个点：示例如下。有不少的algorism致力于区分两个像素点，按照视频的说法，Rayleigh是一种常见的方法。



当两个实物点距离越来越近，就会出现难以区分的情况。区分两个像素点有一些常用的方法。

在Rayleigh方法的定义下，区分两个像素点的公式：也就是在之前的视频中的提到的两个重要公式，XY（lateral方向）和XZ（depth方向）方向上的极限分辨距离：衍射中心点到第一暗斑距离（或者说是第一暗斑的半径）。在XY和XZ上有不同的计算方法，XZ上的长度总要比XY要长。基本结论是：只有一个点在另一个点的衍射第一暗斑之外，两个点才能被分开。



分辨率在XY与XZ方向上的计算。

高NA的镜头分辨率高：



不同NA的镜头的分辨率注释。

从另一个角度来解释分辨率极限：对于一个固定NA的镜头的来说，如果物体小到超过了极限，那么物体的大小就不能够再被体现出来。这说明，在使用显微镜拍摄非常小的物体（比如RNA FISH），每个点几十nm左右，需要考虑用100x的oil来拍，不然无法区分单个的荧光点。



镜头分辨率极限。

如何选择镜头分辨率来实现对物体细微信息的成像呢？Must be sampled at least twice the highest frequency：也就是说，物体上的最细微的结构必须要包含至少两个像素，这样才能精准展示人眼可以分辨的所有细节。
在实际操作中，想要提高成像的分辨率，也就是想要用更多的像素来“组成”一个实体细节，可以使用短波长的激发光、使用高NA的镜头、使用高折射率的镜头媒介（空气到水到甘油到镜油）。另外，当要区分不同的点时，还可以考虑将不同的点用不同的荧光来标记，这样每个点发出的波长不同，不会有重叠的成像，在拍照完将两个点的图像merge在一起就可以还原真实的两点距离。此外，目前已经有非常先进的nanoscopy，在后面的视频里会有介绍。

大力水手

目前来说空间上是minflux，可以做到1-2nm，时间上我不确定，但是minflux的时间分辨率也是出奇的高，但局限于点扫描和本身系统复杂，售价太贵，在国内也只有两台，上海理工顾敏院士团队买了一台2000w，科大也买了一台，接下来北大的席鹏也在计划购置一台。话说，Stefan Hell真的有点牛的，超分辨的几种方法，个人觉得STED技术是最物理的。

检验医师

目镜*物镜=1500，可能是我的眼睛不行，我觉得1000倍就已经是一团浆糊的节奏了。
这个倍数是有讲究的，因为可见光的波长就是这个长度，会有明显的衍射现象。

检验医师

这是一个很大的问题，我抛砖引玉吧
从我粗略的认识来看，这个问题至少涉及了3个诺奖
1999年的化学奖、2008年的化学奖、2014年的化学奖
时间和空间是光学非常重要的概念，有时候还可以相互转化，这其实是两种不同的技术路线
1. 空间分辨力

从空间角度讲，又分近场和远场
如果指分辨力极限，那一定是近场扫描显微镜NSOM，可以达到100nm以下，理论上就不存在分辨力极限。
如果是远场，受到衍射极限的限制。通常分辨力用瑞利判据或者PSF的FWHM来评价，一般不会超过波长量级。2014年诺贝尔化学奖颁给了超分辨荧光显微成像。之所以是化学奖，我个人认为，可能是由于在这个过程中借助了荧光分子，而不是纯粹的物理手段实现的远场超分辨。本质上光学显微镜的超分辨，还是为了观测活体样品，如果是材料，用电镜或者原子力显微镜可以达到远超光学显微镜的分辨力水平。
PALM/STORM都是用时间换空间的技术，但是分辨力应该很难超过STED。STED需要很强的猝灭光，理论上猝灭光足够强就可以达到足够高的分辨力，但是也会伴随着更强的光毒性和损伤。国内席鹏老师应该是做的非常有影响力的，据我不完全了解，可以做到20nm以下的分辨率。另外比较强势的应该是，Stefan Hell大佬的MINFLUX，结合了STED、PALM、STORM的一些技术特点，可以达到10nm以下的分辨力。
以上大部分远场超分辨依然需要借助荧光分子的标记，label-free的技术方法可能会有更广泛的适用性。目前的话，看很多老师做的计算成像、四波混频之类的工作，希望未来会有更广阔的前景。


从显微镜到显纳镜——小于2nm定位精度的光学显纳镜MINFLUX2. 时间分辨力

在空间分辨力部分，会看到很多用时间换空间的技术手段，实际上时间和空间就是可以相互转化的。

换算成距离就是1纳秒光传播30cm，1皮秒光传播300μm，1飞秒光传播300nm。
我们很难去控制探测器采集fs时间尺度发生的事件，但是如果我们把两个事件之间的时间间隔调控到不同的时间尺度，然后反复观测，就可以得到在一段极短时间窗口内发生的一些化学变化。一个fs对应300nm，也就是说，如果两个脉冲光传播的空间距离，可以控制在亚微米水平，就可以实现fs时间尺度内现象的观测。也就是泵浦-探测。除了fs以外，还会有阿秒物理，但是这种时间尺度的问题，就远远超出我的认知了。
这部分我认识就更为有限了，深入的问题可以关注磷酸君 @Phosphates 的文章。
除此之外，如果是超快成像的部分，可以看汪立宏老师、王立代老师的一些工作。能观测到ps时间尺度的光的传播。[1]



光传输的超快成像

人类有没有拍过光没有到达时的照片？