干货 | ELISA实验总翻车？一文教你“避雷”（文末免单福利）

临床医师

上篇推文（点击即可查看）为大家详细介绍了ELISA的基础知识，本期带来满满的实验干货。ELISA实验看似步骤简单，但每个环节都可能成为“数据杀手”！从样本处理到数据分析，如何稳扎稳打？这篇推文总结关键要点，助你轻松得到漂亮数据！文末还有免单福利不容错过哦~

影响ELISA实验结果的因素主要有样本与试剂准备、实验操作细节、以及数据处理这三大块。本文也将围绕这三个部分展开。
当然了，还有另一个非常关键的因素，ELISA试剂盒的选择，这个问题，我们下期回答，敬请期待哦～
样本与试剂准备

01样本准备

ELISA适用样本非常广泛，下表总结了不同样本的处理要点


• 蛋白质提取物的推荐浓度为至少1-2 mg/mL。
• 通常，用样本稀释液将血清、血浆、细胞和组织提取物稀释50%。
• 在使用前，将样本在4°C下以 8000-1000×g 的转速离心5分钟以去除所有沉淀物。

02试剂盒检查

① 确认试剂盒在有效期内
Proteintech ELISA kit 未开启时可在2-8℃条件下存放6个⽉或者在-20℃条件下存放1年，已开启试剂盒可在2-8℃存放7天。
请勿将不同批次的试剂进⾏混⽤！
② 核对组分是否齐全

03试剂准备

试剂回温：实验前，需要将所需试剂在室温平衡20-30 min（HRP标记检测抗体浓缩液不需要平衡室温，即⽤即取）；避免冷凝水稀释试剂浓度。
❗避坑：切勿高温解冻！可提前1小时从-20℃转移至4℃，再室温静置。
洗涤液（1×）：如果洗涤液有晶体析出，37℃加热⾄晶体全部溶解。按1:20稀释倍数进⾏稀释：如取30mL浓缩洗涤液（20×），加⼊570mL超纯⽔或去离⼦⽔，得到洗涤液（1×）。
HRP标记检测抗体（1×）：开盖前瞬时离⼼，按1:100⽐例进⾏稀释，稀释前根据实验所需总量配制（100μL/孔）,实际配制时应多配制0.1-0.2mL。如10μLHRP标记检测抗体浓缩液（100×）加990μL抗体稀释液进⾏配制，轻轻混匀。
待检测样本：不同的样本使⽤其相应的样本稀释液进⾏稀释。如果样本检测值超过标曲最⾼范围，可将样本进⾏⼀定的稀释，使样本的检测值处于标曲范围内，不同样本的稀释倍数需⾃⾏优化，具体请参照对应说明书。样品采集、处理和储存的差异可能导致测值的改变。
梯度稀释的标准品：不同靶点，不同样本不同，具体参照说明书操作。以Mouse IL-6 ELISA Kit（KE10007）为例。检测⼩⿏⾎清和⾎浆样本，使⽤2mLPT1-ec样本稀释液复溶标准品。检测细胞上清样本，使⽤2mLPT1-ef样本稀释液复溶标准品，具体操作如下：


ELISA试剂盒实验操作要点

01ELISA试剂盒实验操作要点

1、酶标板条拆分
个人防护：佩戴手套和口罩，避免手部油脂、汗液或飞沫污染板条。
环境清洁：确保工作台面洁净，避免灰尘或液体残留干扰。提前准备好密封袋、标记笔等工具，避免操作中断，减少板条在室温暴露时间，以免影响酶标记物等温度敏感的试剂。
轻柔操作：轻按板条底部两侧，均匀施力推出。避免用力过猛导致板条变形或孔内液体溅出。确保剩余板条仍牢固固定在框架上，防止松动。拆卸后观察板条是否有裂痕或变形，损坏的板条不可继续使用。
标记与记录：立即标记拆卸板条的信息（如实验编号、日期、样本类型）。
密封保存：未使用的板条放回原铝箔袋，加入干燥剂后密封，避光防潮于4℃保存，并于⼀周之内⽤完。
❗注意：不同批号或实验的板条分开存放，避免误用。

02加样——精准是关键！

更换枪头：在进⾏标准品、样本以及不同试剂加样时，更换枪头，避免接触微孔板的内表⾯，不同的试剂，使⽤不同的加样槽。
避免气泡：加样后若有气泡，用干净枪头轻轻戳破，以免影响OD值读数。
平行样本：建议标准品和样本都做复孔，尽量避免实验误差，确保上样不间断，5-10min完成加样

03孵育——时间与温度控制

温度选择：推荐37℃孵育2h，但高背景时可尝试室温孵育或者减少孵育时间。
覆盖封板膜：防止液体蒸发导致浓度变化（尤其是长时间孵育）。
轻柔摇动：水平摇床低速震荡（如400-500 rpm）可促进抗原抗体结合，缩短孵育时间。

04洗涤——最易出错的环节！

揭开封板膜（动作轻柔，避免动作过⼤导致液体溢出串孔），弃液体，拍⼲。
一浸：洗涤液（1×）洗涤板条，每孔350-400µL，用手轻磕板架四周，每边轻磕3-4下，弃掉洗涤液。
二倒：快速翻转板子，甩净液体（可在吸水纸上轻拍2-3次）。
三控干：倒扣板子于吸水纸上，停留10秒吸残留液。
重复此步骤4次，避免异物进⼊板孔，保持板条⼲燥。
若使⽤⾃动洗板机，板孔加⼊洗涤液之后，可设置30秒的浸泡程序，以提⾼分析的精确度。

05显色与终止：把握时机！

显⾊：每孔加TMB显⾊液100 µL，37℃避光显⾊15-20 min；
终⽌：每孔加终⽌液100µL，蓝⾊变⻩⾊。终⽌液与TMB显⾊液的加样顺序⼀致；
读数：以630nm为校正波⻓，⽤酶标仪在450nm波⻓测量各孔的光密度(OD值)。加⼊终⽌液后5min内进⾏读数，若⽆630nm 波⻓，也可直接使⽤450nm波⻓读数。
❗避坑点
①避光操作：TMB显色液遇光易降解，需保持显⾊底物始终处于避光状态，显⾊底物在加样前应是⽆⾊透明的，如有变⾊，请勿使⽤。
②显色观察：阳性孔应呈现梯度蓝色（标准曲线孔），若颜色过深立即终止，如果颜⾊偏浅，可适当延⻓显⾊时间，不超过30 min；
③终止顺序：与加样顺序一致！先加显色液的孔先加终止液，避免时间差导致显色不均。注意：眼睛和⽪肤避免接触终⽌液。
④板底清洁：用无尘纸擦干板底液体或指纹，避免散射光干扰。

以上是使用Proteintech预包被ELISA试剂盒进行实验时的操作要点，若是选购抗体对套装或抗体对进行ELISA实验则还要进行包被捕获抗体这一步骤。
样本及试剂准备与上文一致，实验步骤除上文所述之外还需要增加包被和封闭两个步骤：
1、包被：每孔加100µL捕获抗体(1×)(参照说明书试剂准备部分进行)⾄96孔板中，确保液体覆盖孔底（避免边缘效应），盖上覆膜，4℃孵育过夜或37℃孵育2小时。
2、封闭： ①揭开封板膜(动作轻柔，避免动作过⼤导致液体溢出串孔)，弃液体，拍⼲；②每孔加⼊200uL通⽤稀释液（0.05%Tween®20, 1%BSA in PBS, pH7.2-7.4,0.2μm filtered，货号：PR10008），盖上覆膜，37℃孵育2h，封闭被包被的孔中剩余的蛋白质结合位点。

ELISA数据处理与分析

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好啦，本期的ELISA干货分享就到这里啦，欲知后事如何，且听下回分解～下期将为您带来ELISA的挑选指南及ELISA常见问题。

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• 中奖后须在1周内确定好所选试剂盒，逾期未兑奖视为自动放弃；
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