手把手教学｜细胞核蛋白的提取步骤及注意事项

生物科研实验室

胞核是遗传信息存储和转录的核心场所，核蛋白包括组蛋白、转录因子、DNA修复酶等，它们在基因表达调控、细胞周期调控等过程中发挥重要作用。与细胞质蛋白不同，核蛋白通常与DNA紧密结合，且容易在细胞裂解过程中被其他细胞器或碎片污染。因此，需要通过特定的方法分离纯化核蛋白，以满足后续实验（如Western Blot、免疫共沉淀、质谱分析等）的需求。 一、实验前的准备工作 1. 材料与试剂清单 •细胞样本：贴壁细胞或悬浮细胞（建议使用新鲜培养的细胞，状态良好）。 •预冷试剂： •PBS缓冲液（pH 7.4） •细胞核裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂，如PMSF、EDTA等） •低渗缓冲液（如含10 mM HEPES、1.5 mM MgCl₂的溶液） •细胞质裂解缓冲液（如含0.1% NP-40或Triton X-100的缓冲液） •仪器设备：离心机、涡旋振荡器、冰盒、预冷的离心管、细胞刮、微量移液器等。 2. 注意事项 •低温操作：全程在冰上进行，避免蛋白降解。 •蛋白酶抑制剂：务必在裂解缓冲液中加入新鲜配制的抑制剂（如PMSF需现用现加）。 •轻柔操作：避免剧烈震荡导至细胞核破裂。 二、细胞核蛋白提取的详细步骤 步骤1：细胞培养与预处理 1.收集对数生长期的细胞（贴壁细胞用细胞刮轻柔刮下，悬浮细胞直接离心收集）。 2.用预冷的PBS洗涤细胞2次（离心条件：1000 rpm，4℃，5分钟），彻底去除培养基残留。 注意：洗涤不彻底可能导至后续裂解效率降低。 步骤2：低渗处理破坏细胞膜 1.将细胞沉淀重悬于适量低渗缓冲液中（体积约为细胞沉淀的5倍）。 2.冰上孵育10-15分钟，使细胞膨胀破裂。 关键点：低渗处理时间需根据细胞类型调整，过长可能导至核膜破裂。 判断标准：显微镜下可见80%以上细胞膜破裂，释放细胞质成分。 步骤3：分离细胞核与细胞质 1.加入细胞质裂解缓冲液（含0.1% NP-40），涡旋震荡10秒。 2.立即离心（1000 g，4℃，10分钟），此时细胞核会沉淀，上清为细胞质蛋白。 3.小心吸弃上清（保留细胞质蛋白备用），保留沉淀（细胞核）。 常见错误：离心速度过高可能将细胞核压碎，导至核蛋白泄漏。 步骤4：裂解细胞核 1.向细胞核沉淀中加入预冷的核裂解缓冲液（含150 mM NaCl、1% SDS等），涡旋混匀。 2.冰上裂解30分钟，期间每10分钟涡旋一次。 注意：若提取转录因子等敏感蛋白，可改用不含SDS的温和裂解液。 步骤5：去除核内DNA与碎片 1.高速离心（12000 g，4℃，15分钟），去除不溶的DNA和细胞碎片。 2.收集上清即为核蛋白提取液。 小技巧：若上清仍浑浊，可重复离心或通过超声破碎DNA。 步骤6：蛋白定量与保存 1.使用BCA或Bradford法测定蛋白浓度。 2.分装后于-80℃保存，避免反复冻融。 提醒：长期保存建议加入甘油（终浓度10%）以稳定蛋白。 三、实验成败的关键注意事项 1. 操作细节决定成败 •轻柔处理细胞核：剧烈震荡或离心速度过高会导至核膜破裂，释放DNA污染样本。 •全程低温操作：从细胞洗涤到裂解均需在冰上进行，防止蛋白酶降解目标蛋白。 •避免交叉污染：细胞质与核蛋白的分离需严格分层，离心后吸弃上清时勿触碰沉淀。 2. 缓冲液pH与成分需精确 •低渗缓冲液的pH需严格控制在7.4-7.6，否则可能影响细胞膜破裂效率。 •核裂解缓冲液中需添加足量NaCl（通常≥150 mM）以溶解核膜蛋白。 3. 离心参数不可随意更改 •分离细胞核的离心速度和时间需根据细胞类型优化，文献中的参数仅作参考。 •高速离心去除DNA时，若时间不足可能导至蛋白中混杂基因组DNA，影响后续实验。 4. 分装保存避免反复冻融 •核蛋白提取液中的SDS等去污剂易导至蛋白聚集，建议分装后一次性使用。 四、常见问题与解决方案 Q1：如何判断细胞核是否破裂？ •显微镜观察：裂解后取少量样本染色（如台盼蓝），完整细胞核应呈圆形且结构完整。 •Western Blot验证：用核蛋白标志物（如Lamin B1）和细胞质标志物（如GAPDH）检测纯度。 Q2：裂解不充分怎么办？ •增加裂解液体积或裂解时间，或使用超声辅助破碎（功率20%，5秒×3次）。 Q3：蛋白浓度过低？ •检查细胞数量是否足够（建议起始量≥10⁷个细胞）。 •优化裂解缓冲液配方，增加去污剂浓度。 Q4：如何选择内参？ •核蛋白常用内参：Lamin A/C、Histone H3；避免使用细胞质内参（如β-actin）。