仪器博物馆 No.28：他叫荧光光谱还是分子荧光光度计？

good · 发表于 2025-3-19 17:20

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仪器博物馆是仪器信息网微信公众号联合仪器导购专场共同创立的一档仪器科普栏目，每周推荐一类仪器，本周是第27期。（文末有常见品牌）

分子荧光光谱仪又称荧光分光光度计有的场合也叫荧光光谱仪，是一种定性、定量分析的仪器。其能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数，从各个角度反映了分子的成键和结构情况。通过对这些参数的测定，不但可以做一般的定量分析, 而且还可以推断分子在各种环境下的构象变化从而阐明分子结构与功能之间的关系。荧光分光光度计的激发波长扫描范围一般是240~1000nm，发射波长扫描范围是200~900nm。可扩展至1700nm或更远。可用于液体、固体样品（如凝胶条）的光谱扫描。
今天小谱就其发展史、检测原理、结构等和大家进行探讨，一文把分子荧光光谱仪讲通透。
（如果读完文章您觉得还有哪些想听的知识点小谱没有讲到，亦或是觉得小谱文章中有哪些观点您不太认同，欢迎您积极留言。)

01 “荧光光谱仪”的诞生和发展

1575年，西班牙的内科医生和植物学家N.Monardes提到在含有一种称为“LignumNephriticum”的木头切片的水溶液中，呈现了为可爱的天蓝色。这是人类第一次记录荧光现象。17世纪，Boyle（1626—1691）和Newton（1643—1727）等科学家再次观察到荧光现象。1852年，英国剑桥大学的数学家和物理学家Sir George Gabriel Stokes（乔治·加布里埃尔·斯托克斯爵士）对荧光产生的机理作了解释，并提出了“荧光”(phenomenon of fluorescence)。

Sir George Gabriel Stokes（1819～1903）
1867年，荧光首次用于分析测定。1928年，Jette和West提出第一台光电荧光计，结束了靠肉眼观察荧光的时代。
1952年，商品荧光分光光度计出现。
1939年，Zworykin和Rajchman发明光电倍增管以后，在增加灵敏度和容许使用分辨率更高的单色器等方面，是一个非常重要的阶段。1943年，Dutton和Bailey提出了一种荧光光谱的手工校正步骤。1948年，Studer推出了第一台自动光谱校正装置。1952年，出现商品化的校正光谱仪器。

02“分子荧光光谱”的原理和结构

原理

在吸收紫外和可见电磁辐射的过程中，分子受激跃迁至激发电子态，大多数分子将通过与其它分子的碰撞以热的方式散发掉这部分能量，部分分子以光的形式放射出这部分能量，放射光的波长不同于所吸收辐射的波长。后一种过程称作光致发光。分子发光包括荧光、磷光、化学发光、生物发光和散射光谱等。基于化合物的荧光测量而建立起来的分析方法称为分子荧光光谱法。
由光源发出的光通过切光器使其变成断续之光，通过激发光单色器变成单色光，此光即为荧光物质的激发光。被测的荧光物质在激发光照射下所发出的荧光，经过单色器变成单色荧光后照射于光电倍增管上，由其所发生的光电流经过放大器放大输至记录仪。一个激发，一个发射，采用双单色器系统，可分别测量激发光谱和荧光光谱。

分子荧光光谱法主要部件及功能

分子荧光光谱仪主要包括光源、激发单色器、样品池、荧光单色器及检测器等主要部件。

1．光源
早期的荧光分光光度计，配有能发生很窄汞线的低压汞灯。使用高压汞灯，谱线被加宽，而且也存在高强度的连续带。然而，一个完整的激发光谱的测定需一种能发射从可见到紫外范围的较高强度的光辐射的灯。氙弧灯能适于此条件，因此，它是目前在荧光分光光度计中最广泛使用的光源。
2．单色器
单色器的作用是把光源发出的连续光谱分解成单色光，并能准确方便地“取出”所需要的某一波长的光，它是光谱仪的心脏部分。单色器主要由狭缝、色散元件和透镜系统组成，其中色散元件是关键部件。色散元件是棱镜和反射光栅或两者的组合，它能将连续光谱色散成为单色光。
（1）棱镜单色器
棱镜单色器是利用不同波长的光在棱镜内折射率不同将复合光色散为单色光的。棱镜色散作用的大小与棱镜制作材料及几何形状有关。常用的棱镜用玻璃或石英制成。可见分光光度计可以采用玻，它适用于紫外、可见整个光谱区。
（2）光栅单色器
光栅作为色散元件具有不少独特的优点。光栅可定义为一系列等宽、等距离的平行狭缝。光栅的色散原理是以光的衍射现象和干涉现象为基础的。常用的光栅单色器为反射光栅单色器，它又分为平面反射光栅和凹面反射光栅两种，其中最常用的是平面反射光栅。光栅单色器的分辨率比棱镜单色器分辨率高（可达±0.2nm），而且它可用的波长范围也比棱镜单色器宽，且入射光80%的能量在一级光谱中。近年来，光栅的刻制复制技术也在不断地改进，其质量也在不断的提高，因而其应用日益广泛。
（3）狭缝
狭缝是单色器的重要组成部分，直接影响到分辨率。狭缝宽度越小，单色性越好，但光强度也随之减少。

03 “分子荧光光谱仪”的应用

化学领域

在许多化学实验或是化学操作过程中会使用到分子荧光光谱仪进行一定的数据操作和数据分析，因为其高性能的操作流程与其自身的特殊性可以广泛使用于多种化学环境当中，为人们的化学操作和实验提供数据支持，在整个化学操作实验过程中可以极为准确的搜集数据。

环境领域

面对许多室外环境与特殊环境人们在计算一定数据时就会想到使用分子荧光光谱仪来进行分析记录，因为不管在何种环境当中它都可以极大限度的发挥它的准确记录功能，让每一个经过分子荧光光谱仪记录的数据都可以十分准确的进行记录。

生物领域

与化学领域有所相同就是生物领域中也较为多的使用到了分子荧光光谱仪，生物领域中的操作涵盖面是非常广的因此许多生物行业中的专家在进行一定操作分析时会使用到分子荧光光谱仪来进行分析记录，面对着纷繁复杂的生物行业领域它已不再是一种新兴的设备仪器已被大众所广泛认可。
分子荧光光谱仪主要应用于化学领域、环境领域及生物领域，运转灵活分子荧光光谱仪深受各行各业专业人士的青睐与喜爱，他们除了运用它进行一定的数据分析和记录之外，还可以使用其高性能进行一定的预设，操作十分方便使用。

04 “分子荧光光谱仪”的分类

分子荧光光谱仪的分类
分子荧光光谱仪分为手控式分光荧光光谱仪，自动记录式分子荧光光谱仪，计算机控制式分子荧光光谱仪。

05 “分子荧光光谱仪”的操作规范

以某品牌分子荧光光谱仪为例
1.开机：接通电源，打开主机开关，点燃（打开）光源后，根据说明书要求启动计算机。
2.检测前准备：参照仪器说明书，在20天内至少进行一次激发校准和发射校准，检测前仪器应预热。
3.工作条件的选择：环境温度应在20℃±5℃;相对湿度不大于70%;电源稳定，无磁场、电场干扰。根据样品的特性及荧光强度，选择合适的仪器工作条件（如狭缝、PM增益、响应时间等）。
4.基本测定
（1）荧光激发光谱测定
      设置仪器参数，扫描发射波长，找到maxλem，以此为发射波长，记录发射强度作为激发波长的函数，便得到激发光谱。
（2）荧光发射光谱测定
      设置仪器参数，扫描激发波长，找到maxλex，以此为激发波长，记录发射强度与发射波长间的函数关系，便得到荧光发射光谱。
（3）差谱测定
      设置仪器参数，选择合适的工作方式，测定背景溶液的发射光谱并储存起来，在一定的工作方式下，扫描样品溶液的发射波长，得到当时的光度值和储存的背景值之间的差示值，即差谱。
（4）峰面积积分
      选择适当的工作方式，对样品溶液进行积分操作，即得到峰面积积分。
（5）荧光强度
      选择合适的测量参数，设置λex、λem，采用定点读数或扫描方式，即可测得所选波长处的荧光强度。
（6）定量测定
      配制一系列已知浓度的标准溶液，在一定的测定条件下，设置λex、λem，按照由稀至浓的次序，测定标准溶液的荧光强度，绘制荧光强度—浓度的工作曲线，不改变仪器参数测定未知溶液的荧光强度，由工作曲线即可求出未知溶液的浓度。

06 “分子荧光光谱仪”的常见故障

以某品牌分子荧光光谱仪为例
检验仪器是否正常工作的简单方法

开机稳定后，作一个纯净水的全波段扫描（200-600nm），与正常仪器水的谱图相比较，看谱图形状是否相近。观察水的散射峰是否在254±2nm左右，观察水的拉曼峰是否在279±2nm左右，看出峰位置是否正确。如果满足上述条件，说明仪器是正常的。

仪器开机自检不通过

计算机系统出错（关机再开）
驱动电路出错
电机故障

显示结果不稳定

光门开启不正常（时开时关，外界电压不正常）
负高压不稳定
光源不稳定
样品本身不稳定

显示结果异常偏低

汞灯寿命到。或汞灯的光不能聚焦在其狭逢上，调节汞灯光源位置（见操作说明书）。
灵敏度设置60和99，量其电压是否在550V和900V左右。不在则调之（在仪器面板后面的负高压电位器）。

无结果显示

无激发光源（汞灯不亮）
无负高压（负高压坏或负高压微动开关没有彻底压下）
光门没有开启（线断或坏）
信号传输线断开

无负高压

负高压开关没有被压下或坏（样品池盖子旁的微动开关）
负高压转换开关在手动状态（在仪器后面板，扳到自动状态）
检查负高压是否正常，检查方法如下：
将仪器灵敏度设置为60，万用表在直流档1000V以上，把负高压的输出头拔下，万用表的一头放在负高压的输出端，另一端接地（负高压的外壳或负高压的接地端），压下样品池下的微动开关，测量电压值在550V左右。同样方法，将灵敏度设置为99，测量其电压值在900V左右，如偏低，调节仪器面板后放大板上的电位器，将其调到900V左右。说明负高压正常。
如果灵敏度设置从60到99变化，测量其电压不是以上范围或变化小，或不变，调节电位器后仍不变，则负高压有问题。换之。

光源突然灭

交流输入电源偏低
汞灯坏
镇流器或触发器坏

出峰位置不正确

怀疑出峰位置有问题最好的方法是检测水的散射峰和拉曼峰，观察水的散射峰是否在254±2nm左右，观察水的拉曼峰是否在279±2nm左右，如在则没问题。
如偏离，调节方法如下：打开仪器，打开光路部分的盖子，调节光栅后面左下方的螺钉，先松开里面的螺钉，调节外面的螺钉，幅度不要太大，大概15度左右为1nm，如波长偏大，则顺时针调节，反之，逆时针调节。调一点，测一次，幅度不要太大，正确后固定里面的螺钉。

07 “分子荧光光谱仪”的常见品牌

到了这里，相信各位已经对‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍分子荧光光谱仪有了很深的了解。如今，分子荧光光谱仪的品牌都有哪些呢？最受关注的又是哪些呢？（以品牌简称首字母排序）

A. 爱丁堡

产品：
爱丁堡一体化稳态瞬态荧光光谱仪FS5爱丁堡-稳态/瞬态荧光光谱仪FLS1000 等

▲ 爱丁堡一体化稳态瞬态荧光光谱仪FS5

B. 安捷伦

产品：
Agilent Cary Eclipse 荧光分光光度计等

▲ Agilent Cary Eclipse 荧光分光光度计

C.岛津

产品：
岛津荧光分光光度计 RF-6000 等