EMSA实验方法及注意事项，一文掌握蛋白-核酸互作核心技术

生物科研实验室

一、实验原理
EMSA的基本原理是基于核酸（通常是DNA或RNA）与蛋白质结合后，其在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳  中的迁移率会发生改变。在自由状态下，核酸分子在电场中会根据自身的大小和电荷以一定速度迁移。当特定的蛋白质与核酸序列发生特异性结合时，形成的核酸 - 蛋白质复合物分子量增大，电荷分布改变，从而导至其在凝胶中的迁移速度减慢，在凝胶上表现为比游离核酸条带位置更高（迁移距离更短）的条带。通过对比加入蛋白质样品前后核酸条带的迁移情况，就可以判断蛋白质与核酸之间是否存在相互作用 。 二、实验材料与试剂准备 1. 关键试剂清单 •标记探针：生物素  /地高辛标记的DNA或RNA（长度建议20-50bp，避免二级结构） •蛋白样品：核提取物或纯化蛋白（浓度≥1 μg/μL，避免反复冻融） •5×结合缓冲液：50 mM Tris-HCl (pH7.5), 250 mM NaCl, 5 mM DTT, 5 mM EDTA, 20%甘油 •竞争DNA：未标记的同源/突变探针（用于冷竞争实验） •非变性聚丙烯酰胺凝胶：6%-8%浓度（配方见文末附表） 2. 仪器设备 •垂直电泳系统、半干转膜仪、化学发光成像仪 三、实验步骤（以生物素标记探针为例）1. 探针设计与标记 •设计要点：靶序列长度20-50bp，包含核心结合位点；两端预留标记区域。 •标记方法：使用生物素末端标记试剂盒（如Thermo Fisher #89818），按说明书操作。 2. 蛋白样本制备 •核提取物制备（以细胞样本为例）： 1.裂解细胞：加入预冷的RIPA缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上静置15分钟。 2.离心：12,000×g，4℃，10分钟，取上清（胞质蛋白）。 3.提取核蛋白：沉淀用高盐缓冲液（20 mM HEPES, 400 mM NaCl）重悬，离心后收集上清。 3. 结合反应体系 按以下顺序在冰上配制（总体积20 μL）： 组分 体积（μL） 终浓度  5×结合缓冲液 4 1×  Poly(dI:dC ) 1 50 ng/μL  蛋白样品 2-5 1-5 μg  生物素标记探针 1 10 fmol  超纯水 补至20 -    关键操作： •预孵育：先加蛋白和缓冲液，室温静置5分钟，再加探针（减少非特异性结合）。 •竞争实验组：提前加入100倍摩尔浓度的未标记探针，孵育10分钟后再加标记探针。 4. 非变性凝胶电泳 •制胶：6%丙烯酰胺（丙烯酰胺:双丙烯酰胺=29:1），1×TBE  缓冲液。 •预电泳：100 V，30分钟（平衡凝胶温度，减少边缘效应）。 •上样：每孔加入10 μL样品，80 V电泳1-2小时（溴酚蓝迁移至胶2/3处停止）。 5. 转膜与检测 •半干转膜：NC膜预湿，电流0.8 mA/cm²，转膜30分钟。 •化学发光：按Streptavidin-HRP试剂盒显影，曝光时间10-60秒。 四、注意事项与避坑指南1. 探针设计避雷 •避免二级结构：用OligoAnalyzer软件预测，Tm值控制在60-70℃。 •标记效率验证：通过凝胶阻滞实验确认标记成功率＞90%。 2. 实验对照组设置 •必需对照组： •游离探针（无蛋白） •冷竞争（过量未标记探针抑制结合） •突变探针（验证结合特异性） •抗体超迁移（加入抗体形成更大复合体，条带进一步滞后） 3. 信号异常的解决方案 问题 可能原因 解决方案  无滞后条带 蛋白失活/探针标记失败 更换新鲜蛋白，验证探针  背景高 膜未封闭彻底 延长封闭时间至1小时  条带拖尾 电压过高/凝胶不均匀 降低电压至80V以下    五、常见问题 Q1：为什么需要非变性凝胶？  变性胶会破坏蛋白结构，导至复合物解离，非变性胶能保持天然构象。 Q2：化学发光信号弱怎么办？ •检查转膜效率：用预染Marker确认是否完全转移。 •优化曝光时间：尝试延长至2分钟。 附表：非变性凝胶配方（以6%为例） 组分 体积（50 mL）  30%丙烯酰胺储存液 10 mL  5×TBE缓冲液 10 mL  超纯水 29.5 mL  10% APS 0.5 mL  TEMED 50 μL