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[分享] 体外诊断试剂主要原材料研究资料-人类 BCR/ABL融合基因P210 RNA扩增检测试剂盒(数字 PCR 法)

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发表于 2025-3-18 05:19 | 显示全部楼层 |阅读模式

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人类 BCR/ABL融合基因P210 RNA扩增检测试剂盒(数字 PCR 法)主要原材料研究资料
主要原材料研究资料
提交申报产品主要原材料的研究资料,内容包括主要原材料的来源、选择、制备方法的研究资料及其质量标准的制订资料、评价结果和质量分析证书,并详细描述原材料的技术指标和验收标准。
其他医疗器械/体外诊断试剂注册资料模板参见:【墨斗鱼平台】注册资料分享
一、概述

白血病是我国十大高发恶性肿瘤之一,近年的临床研究表明,大部分白血病和淋巴瘤存在染色体畸变,如易位、缺失和突变等。染色体易位畸变大部分情况下会形成相关的融合基因,是白血病和淋巴瘤临床诊断的重要指标之一。
由t(9;22)(q34;q11)产生的费城染色体(Ph)在血液肿瘤中具有重要的诊断和预后意义,出现于90%以上的CML、30%成人ALL、2%~20%儿童ALL以及少数AML和MM患者。位于9q34的ABL基因与位于22q11的BCR基因相互易位产生的BCR-ABL融合基因会编码一种癌蛋白(p210BCR-ABL),95%的CML患者表现为P210阳性,在ph阳性ALL中,P210约占1/3,因此融合基因BCR-ABL的亚型P210可作为白血病分型诊断、疗效评价以及治疗监测的可靠指标。
本报告主要是关于人类BCR/ABL融合基因P210RNA扩增检测试剂盒(数字PCR法)主要原材料的研究,包括该试剂盒的相关信息以及主要原料的性状、性能等的研究。
二、人类 BCR/ABL融合基因P210 RNA扩增检测试剂盒(数字PCR法)检测原理及相关信息

2.1检测原理

使用随机引物反转录结合液滴数字PCR(ddPCR)技术进行定量检测。e13a2(b2a2)和e14a2(b3a2)BCR-ABL易位同时扩增、检测和量化。样本为人类血液中提取的总RNA,对FAM通道中的两个BCR-ABL融合转录本e13a2(b2a2)和/或e14a2(b3a2)的副本进行定量检测,并以ABL转录本内源性对照进行定量。将BCR-ABL转录本的数量量化为BCR-ABL/ABL的比率,然后返回国际范围内的值。
2.2人类 BCR/ABL融合基因P210 RNA扩增检测试剂盒(数字PCR法) 产品信息

包装规格:48人份/盒。
储存条件:-20℃条件下避光保存,有效期12个月。拆封后未使用完的试剂请立即-20℃条件下避光保存,并在8周内使用完且反复冻融次数不超过8次。
2.3人类 BCR/ABL融合基因P210 RNA扩增检测试剂盒(数字PCR法) 组分



三、主要原料来源及制备方法

3.1 RNasin:将转染有包含RNasin表达基因的BL21(DE3)大肠杆菌于LB培养基中进行诱导表达;然后将大肠杆菌裂解产物用RNase A亲和层析进行纯化制得。
3.2逆转录酶(c-MMLV酶):将逆转录酶基因插入至载体pET28a上,产生pET28a-MMLV RT质粒,具体合成序列包括3’端添加的纯化标签6×His序列和TAA终止密码子。将此质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞进行表达宿主构建,该质粒诱导表达后产生C端融合6×His纯化标签的MMLV逆转录酶。取发酵菌体以Ni亲和层析柱结合缓冲液重悬后,以细胞高压匀浆破碎仪破碎,低温高速离心收集破碎上清液,4℃环境下使用Ni亲和层析纯化柱进行纯化收集,得到MMLV逆转录酶突变体,配制于存储缓冲液中,低温保存。
3.3热启动TaqDNA聚合酶:
根据GenBank公布的Taq DNA聚合酶基因序列D32013 .1,按照大肠杆菌偏好密码子,人工合成优化的Taq DNA聚合酶基因片段;然后将优化的Taq DNA聚合酶基因片段构建到原核表达载体上,进行大肠杆菌转化和筛选,获得表达Taq DNA聚合酶的重组菌;然后依次进行诱导表达、细胞破壁、热变性、梯度盐析、透析和层析,完成Taq DNA聚合酶的浓缩和纯化;最后,将抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体与Taq DNA聚合酶进行特异性结合,完成Taq DNA聚合酶的配基修饰,即为热启动Taq DNA聚合酶。
3.4DNA引物和探针:使用****核酸分析软件分别对已知的融合基因BCR-ABL(P210)基因的核苷酸序列进行同源性比较,在找到同源区段的基础上,进一步使用****引物设计软件选择并设计寡核苷酸引物和探针。由于所设计的引物和探针均具有互补于BCR-ABL(P210)基因的序列,而且与其他病原体的核苷酸序列没有同源性,也不包括任何常见的核酸内切酶的酶切位点,所以避免了融合基因BCR-ABL(P210)检测的假阴性和假阳性,提高了检测的可靠性和准确度。使用DNA合成装置合成所需的寡核苷酸引物和探针,用分子筛和快速蛋白质液相层析法(FPLC)纯化后进行氨解处理。同样合成所需的探针序列,氨解处理后分别在其5’端标记作为荧光发生基团(报告基团)的6-FAM amidite,并在其3’端标记借助活性连接臂偶联上作为荧光淬灭或抑制基团的BHQ1。以FPLC层析法纯化荧光标记的探针。然后,使用变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶(20%)电泳法和分光光度法物理鉴定所合成的引物和探针。
经检索,BCR/ABL mRNA (e13a2)序列如下:
gcgaacaagggcagcaaggctacggagaggctgaagaagaagctgtcggagcaggagtcactgctgctgcttatgtctcccagcatggccttcagggtgcacagccgcaacggcaagagttacacgttcctgatctcctctgactatgagcgtgcagagtggagggagaacatccgggagcagcagaagaagtgtttcagaagcttctccctgacatccgtggagctgcagatgctgaccaactcgtgtgtgaaactccagactgtccacagcattccgctgaccatcaataaggaagaagcccttcagcggccagtagcatctgactttgagcctcagggtctgagtgaagccgctcgttggaactccaaggaaaaccttctcgctggacccagtgaaaatgaccccaaccttttcgttgcactgtatgattttgtggccagtggagataacactctaagcataactaaaggtgaaaagctccgggtcttaggctataatcacaatggggaatggtgtgaagcccaaaccaaaaatggccaaggctgggtcccaagcaactacatcacgccagtcaacagtctggagaaacactcctggtaccatgggcctgtgtcccgcaatgccgctgagtatctgctgagcagcgggatcaatggcagcttcttggtgcgtgagagtgagagcagtcctggccagaggtccatctcgctgagatacgaagggagggtgtaccattacaggatcaacactgcttctgatggcaagctctacgtctcctccgagagccgcttcaacaccctggccgagttggttcatcatcattcaacggtggccgacgggctcatcaccacgctccattatccagccccaaagcgcaacaagcccactgtctatggtgtgtcccccaactacgacaagt
BCR/ABL mRNA (e14a2)序列如下:gcgaacaagggcagcaaagctacggagaggctgaagaagaagctgtcggagcaggagtcactgctgctgcttatgtctcccagcatggccttcagggtgcacagccgcaacggcaagagttacacgttcctgatctcctctgactatgagcgtgcagagtggagggagaacatccgggagcagcagaagaagtgtttcagaagcttctccctgacatccgtggagctgcagatgctgaccaactcgtgtgtgaaactccagactgtccacagcattccgctgaccatcaataaggaagatgatgagtctccggggctctatgggtttctgaatgtcatcgtccactcagccactggatttaagcagagttcaaaagcccttcagcggccagtagcatctgactttgagcctcagggtctgagtgaagccgctcgttggaactccaaggaaaaccttctcgctggacccagtgaaaatgaccccaaccttttcgttgcactgtatgattttgtggccagtggagataacactctaagcataactaaaggtgaaaagctccgggtcttaggctataatcacaatggggaatggtgtgaagcccaaaccaaaaatggccaaggctgggtcccaagcaactacatcacgccagtcaacagtctggagaaacactcctggtaccatgggcctgtgtcccgcaatgccgctgagtatctgctgagcgcgggatcaatggcagcttcttggtgcgtgagagtgagagcagtcctggccagaggtccatctcgctgagatacgaagggagggtgtaccattacaggatcaacactgcttctgatggcaagctctacgtctcctccgagagccgcttcaacaccctggccgagttggttcatcatcattcaacggtggccgacgggctcatcaccacgctccattatccagccccaaagcgcaacaagcccactgtctatggtgtgtcccctaactacgacaagt
e13a2、e14a2引物和探针序列一致。
BCR-ABL正向引物序列:tccacagcattccgctgac
BCR-ABL反向引物序列位置:tttgagcctcagggtctgagtg
BCR-ABL探针序列:gcccttcagcggccagtagcatct
tgatgagtctccggggctctatgggtttctgaatgtcatcgtccactcagccactggatttaagcagagttcaaa为e14a2比e13a2多出部分。
内参基因ABL引物和探针的设计原则同上,5’端标记荧光发生基团(报告基团)为HEX。
经检索,ABL mRNA序列如下:
gcgaacaagggcagcaaggctacggagaggctgaagaagaagctgtcggagcaggagtcactgctgctgcttatgtctcccagcatggccttcagggtgcacagccgcaacggcaagagttacacgttcctgatctcctctgactatgagcgtgcagagtggagggagaacatccgggagcagcagaagaagtgtttcagaagcttctccctgacatccgtggagctgcagatgctgaccaactcgtgtgtgaaactccagactgtccacagcattccgctgaccatcaataaggaagaagcccttcagcggccagtagcatctgactttgagcctcagggtctgagtgaagccgctcgttggaactccaaggaaaaccttctcgctggacccagtgaaaatgaccccaaccttttcgttgcactgtatgattttgtggccagtggagataacactctaagcataactaaaggtgaaaagctccgggtcttaggctataatcacaatggggaatggtgtgaagcccaaaccaaaaatggccaaggctgggtcccaagcaactacatcacgccagtcaacagtctggagaaacactcctggtaccatgggcctgtgtcccgcaatgccgctgagtatctgctgagcagcgggatcaatggcagcttcttggtgcgtgagagtgagagcagtcctggccagaggtccatctcgctgagatacgaagggagggtgtaccattacaggatcaacactgcttctgatggcaagctctacgtctcctccgagagccgcttcaacaccctggccgagttggttcatcatcattcaacggtggccgacgggctcatcaccacgctccattatccagccccaaagcgcaacaagcccactgtctatggtgtgtcccccaactacgacaagt
BCR/ABL mRNA (e14a2)序列如下:gcgaacaagggcagcaaagctacggagaggctgaagaagaagctgtcggagcaggagtcactgctgctgcttatgtctcccagcatggccttcagggtgcacagccgcaacggcaagagttacacgttcctgatctcctctgactatgagcgtgcagagtggagggagaacatccgggagcagcagaagaagtgtttcagaagcttctccctgacatccgtggagctgcagatgctgaccaactcgtgtgtgaaactccagactgtccacagcattccgctgaccatcaataaggaagatgatgagtctccggggctctatgggtttctgaatgtcatcgtccactcagccactggatttaagcagagttcaaaagcccttcagcggccagtagcatctgactttgagcctcagggtctgagtgaagccgctcgttggaactccaaggaaaaccttctcgctggacccagtgaaaatgaccccaaccttttcgttgcactgtatgattttgtggccagtggagataacactctaagcataactaaaggtgaaaagctccgggtcttaggctataatcacaatggggaatggtgtgaagcccaaaccaaaaatggccaaggctgggtcccaagcaactacatcacgccagtcaacagtctggagaaacactcctggtaccatgggcctgtgtcccgcaatgccgctgagtatctgctgagcgcgggatcaatggcagcttcttggtgcgtgagagtgagagcagtcctggccagaggtccatctcgctgagatacgaagggagggtgtaccattacaggatcaacactgcttctgatggcaagctctacgtctcctccgagagccgcttcaacaccctggccgagttggttcatcatcattcaacggtggccgacgggctcatcaccacgctccattatccagccccaaagcgcaacaagcccactgtctatggtgtgtcccctaactacgacaagt
e13a2、e14a2引物和探针序列一致。
BCR-ABL正向引物序列:tccacagcattccgctgac
BCR-ABL反向引物序列位置:tttgagcctcagggtctgagtg
BCR-ABL探针序列:gcccttcagcggccagtagcatct
tgatgagtctccggggctctatgggtttctgaatgtcatcgtccactcagccactggatttaagcagagttcaaa为e14a2比e13a2多出部分。
内参基因ABL引物和探针的设计原则同上,5’端标记荧光发生基团(报告基团)为HEX。
经检索,ABL mRNA序列如下:
gttaacaggcgcgtcccggccaggcggagacgcggccgcggccatgggcgggcgcgggcgcgcggggcggcggtgagggcggctggcggggccgggggcgccgggggggcgcgcgggccgagccgggcctgagccgggcccgcggaccgagctgggagaggggttccggcccccgacgtgctggcgcgggaaaatgttggagatctgcctgaagctggtgggctgcaaatccaagaaggggctgtcctcgtcctccagctgttatctggaagaagcccttcagcggccagtagcatctgactttgagcctcagggtctgagtgaagccgctcgttggaactccaaggaaaaccttctcgctggacccagtgaaaatgaccccaaccttttcgttgcactgtatgattttgtggccagtggagataacactctaagcataactaaaggtgaaaagctccgggtcttaggctataatcacaatggggaatggtgtgaagcccaaaccaaaaatggccaaggctgggtcccaagcaactacatcacgccagtcaacagtctggagaaacactcctggtaccatgggcctgtgtcccgcaatgccgctgagtatctgctgagcagcgggatcaatggcagcttcttggtgcgtgagagtgagagcagtcctggccagaggtccatctcgctgagatacgaagggagggtgtaccattacaggatcaacactgcttctgatggcaagctctacgtctcctccgagagccgcttcaacaccctggccgagttggttcatcatcattcaacggtggccgacgggctcatcaccacgctccattatccagccccaaagcgcaacaagcccactgtctatggtgtgtcccccaactacgacaagtgggagatggaacgcacggacatcaccatgaagcacaagctgggcgggggccagtacggggaggtgtacgagggcgtgtggaagaaatacagcctgacggtggccgtgaagaccttgaaggaggacaccatggaggtggaagagttcttgaaagaagctgcagtcatgaaagagatcaaacaccctaacctggtgcagctccttggggtctgcacccgggagcccccgttctatatcatcactgagttcatgacctacgggaacctcctggactacctgagggagtgcaaccggcaggaggtgaacgccgtggtgctgctgtacatggccactcagatctcgtcagccatggagtacctggagaagaaaaacttcatccacagagatcttgctgcccgaaactgcctggtaggggagaaccacttggtgaaggtagctgattttggcctgagcaggttgatgacaggggacacctacacagcccatgctggagccaagttccccatcaaatggactgcacccgagagcctggcctacaacaagttctccatcaagtccgacgtctgggcatttggagtattgctttgggaaattgctacctatggcatgtccccttacccgggaattgacctgtcccaggtgtatgagctgctagagaaggactaccgcatggagcgcccagaaggctgcccagagaaggtctatgaactcatgcgagcatgttggcagtggaatccctctgaccggccctcctttgctgaaatccaccaagcctttgaaacaatgttccaggaatccagtatctcagacgaagtggaaaaggagctggggaaacaaggcgtccgtggggctgtgagtaccttgctgcaggccccagagctgcccaccaagacgaggacctccaggagagctgcagagcacagagacaccactgacgtgcctgagatgcctcactccaagggccagggagagagcgatcctctggaccatgagcctgccgtgtctccattgctccctcgaaaagagcgaggtcccccggagggcggcctgaatgaagatgagcgccttctccccaaagacaaaaagaccaacttgttcagcgccttgatcaagaagaagaagaagacagccccaacccctcccaaacgcagcagctccttccgggagatggacggccagccggagcgcagaggggccggcgaggaagagggccgagacatcagcaacggggcactggctttcacccccttggacacagctgacccagccaagtccccaaagcccagcaatggggctggggtccccaatggagccctccgggagtccgggggctcaggcttccggtctccccacctgtggaagaagtccagcacgctgaccagcagccgcctagccaccggcgaggaggagggcggtggcagctccagcaagcgcttcctgcgctcttgctccgcctcctgcgttccccatggggccaaggacacggagtggaggtcagtcacgctgcctcgggacttgcagtccacgggaagacagtttgactcgtccacatttggagggcacaaaagtgagaagccggctctgcctcggaagagggcaggggagaacaggtctgaccaggtgacccgaggcacagtaacgcctccccccaggctggtgaaaaagaatgaggaagctgctgatgaggtcttcaaagacatcatggagtccagcccgggctccagcccgcccaacctgactccaaaacccctccggcggcaggtcaccgtggcccctgcctcgggcctcccccacaaggaagaagctggaaagggcagtgccttagggacccctgctgcagctgagccagtgacccccaccagcaaagcaggctcaggtgcaccagggggcaccagcaagggccccgccgaggagtccagagtgaggaggcacaagcactcctctgagtcgccagggagggacaaggggaaattgtccaggctcaaacctgccccgccgcccccaccagcagcctctgcagggaaggctggaggaaagccctcgcagagcccgagccaggaggcggccggggaggcagtcctgggcgcaaagacaaaagccacgagtctggttgatgctgtgaacagtgacgctgccaagcccagccagccgggagagggcctcaaaaagcccgtgctcccggccactccaaagccacagtccgccaagccgtcggggacccccatcagcccagcccccgttccctccacgttgccatcagcatcctcggccctggcaggggaccagccgtcttccaccgccttcatccctctcatatcaacccgagtgtctcttcggaaaacccgccagcctccagagcggatcgccagcggcgccatcaccaagggcgtggtcctggacagcaccgaggcgctgtgcctcgccatctctaggaactccgagcagatggccagccacagcgcagtgctggaggccggcaaaaacctctacacgttctgcgtgagctatgtggattccatccagcaaatgaggaacaagtttgccttccgagaggccatcaacaaactggagaataatctccgggagcttcagatctgcccggcgacagcaggcagtggtccagcggccactcaggacttcagcaagctcctcagttcggtgaaggaaatcagtgacatagtgcagaggtagcagcagtcaggggtcaggtgtcaggcccgtcggagctgcctgcagcacatgcgggctcgcccatacccgtgacagtggctgacaagggactagtgagtcagcaccttggcccaggagctctgcgccaggcagagctgagggccctgtggagtccagctctactacctacgtttgcaccgcctgccctcccgcaccttcctcctccccgctccgtctctgtcctcgaattttatctgtggagttcctgctccgtggactgcagtcggcatgccaggacccgccagccccgctcccacctagtgccccagactgagctctccaggccaggtgggaacggctgatgtggactgtctttttcatttttttctctctggagcccctcctcccccggctgggcctccttcttccacttctccaagaatggaagcctgaactgaggccttgtgtgtcaggccctctgcctgcactccctggccttgcccgtcgtgtgctgaagacatgtttcaagaaccgcatttcgggaagggcatgcacgggcatgcacacggctggtcactctgccctctgctgctgcccggggtggggtgcactcgccatttcctcacgtgcaggacagctcttgatttgggtggaaaacagggtgctaaagccaaccagcctttgggtcctgggcaggtgggagctgaaaaggatcgaggcatggggcatgtcctttccatctgtccacatccccagagcccagctcttgctctcttgtgacgtgcactgtgaatcctggcaagaaagcttgagtctcaagggtggcaggtcactgtcactgccgacatccctcccccagcagaatggaggcaggggacaagggaggcagtggctagtggggtgaacagctggtgccaaatagccccagactgggcccaggcaggtctgcaagggcccagagtgaaccgtcctttcacacatctgggtgccctgaaagggcccttcccctcccccactcctctaagacaaagtagattcttacaaggccctttcctttggaacaagacagccttcacttttctgagttcttgaagcatttcaaagccctgcctctgtgtagccgccctgagagagaatagagctgccactgggcacctgcgcacaggtgggaggaaagggcctggccagtcctggtcctggctgcactcttgaactgggcgaatgtcttatttaattaccgtgagtgacatagcctcatgttctgtgggggtcatcagggagggttaggaaaaccacaaacggagcccctgaaagcctcacgtatttcacagagcacgcctgccatcttctccccgaggctgccccaggccggagcccagatacgggggctgtgactctgggcagggacccggggtctcctggaccttgacagagcagctaactccgagagcagtgggcaggtggccgcccctgaggcttcacgccgggagaagccaccttcccaccccttcataccgcctcgtgccagcagcctcgcacaggccctagctttacgctcatcacctaaacttgtactttatttttctgatagaaatggtttcctctggatcgttttatgcggttcttacagcacatcacctctttgcccccgacggctgtgacgcagccggagggaggcactagtcaccgacagcggccttgaagacagagcaaagcgcccacccaggtcccccgactgcctgtctccatgaggtactggtcccttccttttgttaacgtgatgtgccactatattttacacgtatctcttggtatgcatcttttatagacgctcttttctaagtggcgtgtgcatagcgtcctgccctgccccctcgggggcctgtggtggctccccctctgcttctcggggtccagtgcattttgtttctgtatatgattctctgtggttttttttgaatccaaatctgtcctctgtagtattttttaaataaatcagtgtttacattagaa
其中ABL正向引物:5’-GACGTCTGGGCATTTGGAGTA-3’
ABL反向引物位置:5’-ttgacctgtcccaggtgtatga-3’
ABL探针:5’-atggcatgtccccttacccggga-3’
3.5去核酸酶水:用超纯的去离子水经DEPC处理后,再经过高压灭菌而来。经检测无核酸酶和蛋白酶活性,可用于cDNA合成、体外转录、RNA提取等对核酸酶敏感的分子生物学试验。
3.6 K562细胞系:K-562是由Lozzio从一位临终的53岁女性慢性骨髓性白血病患者的胸水中建立。K-562细胞被归入高度未分化的粒性白细胞类,Erson等对其表面膜性质的研究表明:K-562细胞是一株人类红白血病细胞。它能表达BCR-ABL1 e14a2(b3a2) ,是WHO第一代BCR-ABL1融合基因标准物质NIBSC code: 09/138所使用的细胞株。通过细胞传代培养获得。
3.7 HL60 细胞系:BCR-ABL1 阴性细胞系,该细胞由Collins SJ从一位患有急性早幼粒细胞性白血病的36岁白人女性的外周血中分离建立。是WHO第一代BCR-ABL1融合基因标准物质NIBSC code: 09/138所使用的细胞株(用做内参)。通过细胞传代培养获得。
三、主要原料选择及质量标准制定资料

4.1逆转录酶(c-MMLV酶的选择与质量标准的制定)

4.1.1制定逆转录酶活性的检测方法
4.1.1.1实验仪器:
荧光PCR仪。
4.1.1.2试剂
4.1.1.2.1 发夹型寡核苷酸序列(T2),序列为:
5'-tagcgaaggatgtgaacctaatcecTGCTCCCGCGGCCGatctgcCGGCCGCGGGAGCA-3'
4.1.1.2.2 dNTP。
注:dGTP:三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸;dATP:三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸;dTTP:三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸;dCTP:三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸,dNTP;三磷酸碱基脱氧核苷酸,包括 dGTP、dATP、dTTP、dCTP。包括dCTP、dATP、dTTP、dGTP。
4.1.1.2.3 荧光核酸染料。
4.1.1.2.4 Lamda DNA标准品。
4.1.1.3溶液的配制
(1)1×TE溶液:10 mmol/L Tris-HCl,1 mmol/L乙二胺四乙酸二钠溶液,pH 8.5(25 ℃)。
(2)PCR 缓冲液;500 mmol/LTris-HCl,750 mmol/L 氯化钾溶液,100 mmol/L DTT,pH 8.5 (25 ℃)。
(3)Lambda DNA预染液:以8.5 μL:1μL:0.5 μL的比例分别量取纯化水、10×PCR缓冲液和荧光核酸染料加入离心管,在漩涡混匀器上振荡混匀1 min 后在微型离心机上离心数秒,储存于2 ℃~8℃。
(4)氯化镁溶液:25 mmol/L。;
(5)酶稀释缓冲液:10 mmol/L Tris-HCl,0.1 mmol/L 乙二胺四乙酸二钠溶液,1 mmol/L DTT,50%(体积分数)甘油,pH8.0(25 ℃)。
(6) T2 溶液:将发夹型寡核苷酸序列(T2)干粉按照合成单上的说明稀释到 100 μmol/L,储存于-20 ℃。使用时从-20 ℃取出平衡至室温,于漩涡混匀器上混匀10 s,在微型离心机上离心数秒。
(7)dNTP混合液,将dNTP中的dCTP、dATP、dTTP、dGTP等体积进行温合,于漩涡混匀器上混匀10s,在微型离心机上离心数秒,配制成25 mmol/L的dNTP混合液。
(8)Lambda DNA标准品:使用1×TE溶液将Lambda DNA 标准品进行4倍连续梯度稀释,得到100μg/mL、25μg/mL、12.5 μg/mL、6.25 μg/mL、3.125 μg/mL、1.5625μg/mL和0.78125μg/mL的8个浓度梯度溶液,以相同体积的1×TE溶液作为背景对照。各梯度溶液和背景对照分别加入等体积的预染液,于漩涡混匀器上混匀10 s,在微型离心机上离心数秒,以 20 μL/管分装于PCR八联管内,每个梯度3个重复,盖紧管盖,在微型离心机上离心数秒后备用。
(9)M-MLV反转录酶梯度释溶液,根据标定的酶比活力,使用酶稀释缓冲液对M-MLV反转录酶进行适当稀释(如标定浓度为200 U/μL,则可2倍稀释,得到2×、4×的梯度稀释液)。该步骤需在冰上进行。
4.1.1.4试验步骤
4.1.1.4.1 聚合反应液的配制与分装
4.1.1.4.1.1 在微量离心管中按照表 1的比例配制聚合反应液(冰上配制),聚合反应液配制完成后,在漩涡混匀器涡旋混匀10 s,微型离心机离心数秒。
配制总体积计算见下式:
V=[3×(n+1)+1]×V1
式中:
V—总体积,单位为微升(μL);
3 —重复次数;
n—M-MLV反转录酶的稀释梯度数;
1—前一个1表示空白对照数;后一个1表示预留损失数量;
V—表示1个反应用量,见表1,单位为微升(μL)。
表1聚合反应液配比


4.1.1.4.1.2 将 4.1.5.1.1中的聚合反应液平均分装到 n 个(n为 M-MLV反转录酶的稀释梯度数)微量离心管中,分别加入1.2 μL 的各浓度梯度的 M-MLV反转录酶梯度稀释溶液和空白对照(酶稀释缓冲液),在漩涡混匀器涡旋混匀10 s,微型离心机离心数秒。各管混合液以 20 μL/管,分装于PCR八联管内,每管混合液3个重复,盖紧管盖,在微型离心机上离心数秒后备用。
4.1.1.4.2运行程序
在荧光 PCR仪上设置如下温度程序:
37℃ 16s
荧光采集通道:SYBR
120个循环
将装有Lambda DNA标准品和聚合反应液的 PCR八联管置干荧光 PCR.仪中.启动温康程序,开始聚合反应。
4.1.1.5数据分析
4.1.1.5.1 Lambda DNA标准曲线的制作
使用荧光 PCR仪的软件打开数据,导出文件,按以下步骤进行,按下式计算:
a)选取数据文件中 Lambda DNA 标准品和背景对照的第 25个循环的荧光值,并计算平均荧光值。
b) 将各梯度 Lambda DNA标准品的荧光值减掉背景对照的平均荧光值,得到净荧光值。
c) 计算各梯度净荧光值的平均值和标准偏差 SD。
d) 以Lambda DNA标准品 DNA量(ng)为 X 轴,以各梯度净荧光值的平均值为Y轴,标准偏差SD 为错误值进行多项式拟合分析,制作工作曲线,从中获得净荧光值与双链 DNA 浓度的关系曲线如下,R2≥0.98。
y=A+Bx
式中:
A —线性方程拟合曲线的截距;
B—线性方程拟合曲线的斜率;
C—y -荧光值;
x-—双链DNA的量,单位为纳克(ng)。
4.1.1.5.2 聚合反应新生成的双链 DNA量的计算
选取 Excel文件中待检 M-MLV反转录酶的第 70 个循环的荧光数据。首先计算空白对照3个重复的平均荧光值,将各梯度 M-MLV反转录酶的荧光值减掉空白对照的平均荧光值,得到净荧光值,计算各梯度净荧光值的平均值(y1)。将各净荧光值代人上式计算聚合反应新生成的双链 DNA量(x1)。
4.1.1.5.3 M-MLV反转录酶梯度条件下的 dNTP消耗量计算
M-MLV反转录酶梯度条件下的 dNTP消耗量以y2表示,单位为 nmol,按下式计算:
y2=x1/(2×324.5)
式中:
x1——新生成的双链DNA量,单位为纳克(ng);
2——双链 DNA由2条单链 DNA组成;
324.5-—dNTP的相对平均分子质量。
4.1.1.5.4 M-MLV反转录酶活力计算
根据M-MLV反转录酶活性单位定义,M-MLV反转录酶酶活力以S表示,单位为U/μL。选择在0.014 nmol~0.196 nmol 范围内的 dNTP消耗量按照下式计算:
S=(y2+0.045)×D/0.0012
式中:
y2——dNTP消耗量,单位为纳摩尔(nmol);
D——酶的稀释倍数。
4.1.2制定逆转录酶核酸外切酶活性的检测方法。
4.1.2.1 仪器和设备
4.1.2.1.1 恒温水浴槽。
4.1.2.1.2 台式离心机。
4.1.2.1.3 超净工作台。
4.1.2.1.4 恒温培养箱。
4.1.2.2 材料
4.1.2.2.1 高纯 CCC pUC19 DNA。
4.1.2.2.2 T4 DNA连接酶。
4.1.2.2.3 10× T4 DNA 连接酶缓冲液:500 mmol/L Tris-HCl 缓冲液(pH7.8),100 mmol/L Mg2+,10 mmol/L ATP,100 mmol/L DTT。
4.1.2.2.4 LB培养液。
4.1.2.2.5 氯仿-异戊醇(24:1,体积比)。
4.1.2.2.6 大肠杆菌DH5a(感受态)。
4.1.2.2.7 LB平板【含β-半乳糖苷酶,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG),氨苄青霉素】。
4.1.2.3 实验步骤
4.1.2.3.1 长时程过量酶切
取10 μg 高纯 CCC pUC19 DNA 置于一只微量离心管中,加入 20 μL 10× BamHI缓冲液和150 μL水,充分混匀后平均分成A和B两管;A管加入5 μL BamHI(50 U~100 U)和5 μL水,达总体积100 μL;B管加人5μL BamHI(50 U~100 U)和5 μL M-MLV反转录酶(1 μg/μL)。混匀后置于37 ℃水浴槽,1 h后各取出 40 μL,其中 20 μL(标记 A1号和 B1号)待电泳检测,另 20 μL(标记A2号和 B2号)待连接及蓝白斑计数;所剩60 μL继续酶切达10 h 以上,又将它各均分为3管,分别标记A3、B3、A4、B4、A5、B5号。
4.1.2.3.2 电泳
4.1.2.3.2.1 取出 A1、B1、A3、B3号管,加入载样缓冲液,准备电泳检测。
4.1.2.3.2.2  1.5%琼脂糖,电泳电压5V/cm~10 V/cm,当溴酚蓝线到达凝胶板 2/3 时停止电泳,取出凝胶板置于紫外透光分析仪观察和拍照。
4.1.2.3.3 连接
4.1.2.3.3.1 回收 DNA
取出 A2、B2、A4、B4、A5、B5号管,各加入 20 μL氯仿-异戊醇先脱去杂蛋白,再沉淀出DNA,并真空干燥样品。
4.1.2.3.3.2 连接反应
每管加入2 μL10× T4 DNA连接酶缓冲液,2U T4 DNA连接酶,加入水达总体积 20 μL,混匀后置于15℃水浴槽8 h。
4.1.2.3.3.3 转化与铺板
4.1.2.3.3.3.1 将感受态菌液加入含连接处理过的 DNA 微量离心管内,轻混,置于4 ℃冰浴槽0.5 h 以上。
4.1.2.3.3.3.2 将上述6只微量离心管移到 42 ℃水浴中热击2 min,迅即取出再置于4 ℃冰浴槽0.5 h 以上。
4.1.2.3.3.3.3 向上述6只微量离心管各加入1 mL LB培养液,轻混,置于37 ℃水浴槽1h。
4.1.2.3.3.3.4 将18块固态LB板,分别标上 A2、B2、A4、B4、A5、B5号,每号均有3块板;在超净工作台铺板,每板加入上述菌液 200 μL;待板上菌液不会流动时,翻转平板,置于37℃恒温培养箱8h 以上。
4.1.2.3.3.3.5 计算每块板蓝白斑数量,再算出每号管对应的每个处理的蓝白斑总数及百分比。
4.1.2.4 结果判定
在电泳板上,A1、B1、A3、B3号的谱带没有明显差异,说明长时程过量酶处理对 DNA 没有造成额外的切割。B2、B4、B5号和 A2、A4、A5号的白斑总数与其蓝斑总数相比,若比值小于1/9,则判定样品不含核酸外切酶;若比值大于或等于1/9,则判定样品含有核酸外切酶。
4.1.3制定逆转录酶核酸内切酶活性检测方法。
4.1.3.1 仪器
4.1.3.1.1 电泳仪,备电泳槽。
4.1.3.1.2 分析天平(万分之一)。
4.1.3.1.3 紫外透光分析仪。
4.1.3.2 实验步骤
4.1.3.2.1 pUC19 质粒反应
4.1.3.2.1.1 在测试管里先后加入4μLpUC19 质粒 DNA(1μg/μL)、14μL水、2 μL酶,振荡器混匀,水浴1 h。
4.1.3.2.1.2 在对照管里先后加入4 μL pUC19 质粒 DNA(1 μg/μL)、16 μL水,振荡器混匀,水浴1h。
4.1.3.3 电泳
1%~1.5%琼脂糖凝胶,电泳电压5V/cm~10 V/cm,当溴酚蓝线到达凝胶板 2/3时停止电泳,取出凝胶板置于紫外透光分析仪观察和拍照。
4.1.3.4 结果判定
在电泳板上,肉眼观察。若测试管和对照管的谱带一致,则判定样品中不含有内切酶;若不一致,则判定样品中含有内切酶。
4.1.4确定逆转录酶核酸内切酶质量标准及验收指标
4.1.4.1 外观
澄清透明的液体,无沉淀。
4.1.4.2 酶活力
按4.1.1的要求检查,酶活力≥200 U/μL。
4.1.4.3 杂质
按4.1.2和4.1.3的要求检查,不应含有核酸外切酶和核酸内切酶。
4.1.5逆转录酶核酸内切酶的选择
按上述要求检测结果如下:


结论:在其他指标满足要求的前提下,B厂家酶活力更好,选择B厂家作为供应商,A厂家作为备用供应商。
4.2 TaqDNA聚合酶的选择及质量标准的制定

4.2.1 制定TaqDNA聚合酶活性的检测方法
A.1 仪器设备
全自动医用PCR 分析系统。
A.2 试剂
A.2.1 发夹型寡核苷酸序列(T2),序列为:
5'-tagcgaaggatgtgaacctaatcccTGCTCCCGCGGCCGatctgcCGGCCGCGGGAGCA-3'
A.2.2 dNTP。
注:包括 dCTP、dATP、dTTP、dGTP。
A.2.3 PicoGreen 染料。
A.2.4 Lambda DNA标准品。
A.3 试剂溶液配制
A.3.1 1×TE溶液:10mmol/L Tris-HCl,1 mmol/L EDTA·2Na,pH 8.5(25 ℃)。
A.3.2 PCR buffer:250 mmol/L Tris-HCl,50 mmol/L(NH4)2SO4,500 mmol/L KCl,1%(体积分数)Tritonx-100,pH8.5(25℃)。
A.3.3 Lambda DNA预染液:以8.5 μL:1 μL:0.5 μL 的比例分别量取纯化水、10×PCR buffer 和PicoGreen染料加入EP管;在漩涡混匀器上振荡混匀1 min后在微型离心机上离心数秒.储存干 2℃~8℃。
A.3.4 MgCl2。溶液:25 mmol/L MgCl2·6H2O。
A.3.5 酶稀释缓冲液:10 mmol/L Tris-HCl,0.1 mmol/L EDTA·2Na,1 mmol/L DTT.50 %(体积分数)甘油.pH8.0(25℃)。
A.3.6 T2溶液:将发夹型寡核苷酸序列(T2)干粉按照合成单上的说明稀释到100 μmol/L,储存于-20℃。使用时从-20 ℃取出平衡至室温,于漩涡混匀器上混匀 10 s;在微型离心机上离心数秒。
A.3.7 dNTP混合液:将dNTP中的 dCTP、dATP、dTTP、dGTP等体积进行混合,于漩涡混匀器上混匀 10 s,在微型离心机上离心数秒,配制成浓度为 25 mmol/L的 dNTP混合液。
A.3.8 Lambda DNA标准品溶液:使用1×TE溶液将 Lambda DNA标准品进行 4倍连续梯度稀释,得到 100 μg/mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL、6.25 μg/mL、3.125 μg/mL、1.562 5 μg/mL 和0.781 25 μg/mL 8个浓度梯度溶液,以相同体积的1×TE溶液作为背景对照。各梯度溶液和背景对照分别加入等体积的预染液,于漩涡混匀器上混匀10 s,在微型离心机上离心数秒,以 20 μL/管分装于PCR八联管内,每个梯度3个重复,盖紧管盖,在微型离心机上离心数秒后备用。
A.3.9 Taq DNA聚合酶梯度稀释溶液:根据标定的酶比活力,使用酶稀释缓冲液对 Taq DNA聚合酶进行适当稀释(如标定浓度为5000 U/mL,即5U/uL。则可 2倍稀释,得到2×、4×,8×,16×的梯度稀释液)。该步骤应在冰上进行。
A.4 实验步骤
A.4.1聚合反应液的配制与分装
A.4.1.1在 EP管中按照表 2 的比例配制聚合反应液(冰上配制)聚合反应液配制完成后;在漩涡混匀器涡旋混匀10 s,微型离心机离心数秒。
注∶配制总体积计算见式(2):
总体积 =[3×(n+1)+1]×V.......…(A.1)
式中∶
3 —重复次数;
n —Tag DNA聚合酶稀释梯度;
1 —前一个"1"表示空白对照数.后一个"1"表示预留损失数量;
V1—1个反应用量,见表2。
表2聚合反应液配比


A.4.1.2 将A.4.1.1中的聚合反应液平均分装到n个(n为 Taq DNA的稀释梯度数)EP管中,分别加入 1.3 μL 的各浓度梯度的 Taq DNA聚合酶梯度稀释溶液和空白对照(酶稀释缓冲液),在漩涡混匀器涡旋混匀10 s,微型离心机离心数秒。各管混合液以20 μL/管,分装于PCR八联管内,每管混合液3个重复,盖紧管盖,在微型离心机上离心数秒后备用。
A.4.2 运行程序
在全自动医用PCR分析系统上设置如下温度程序∶
74 ℃ 6 s
荧光采集通道∶SYBR
120 cycles
将装有Lambda DNA标准品和聚合反应液的 PCR八联管置于全自动 PCR分析系统中,启动温度程序,开始聚合反应。
A.5 数据分析
A.5.1 Lambda DNA标准曲线的制作
使用全自动医用 PCR分析系统的软件打开数据,导出 Excel文件。
选取Excel文件中Lambda DNA 标准品和背景对照的第 30cycles 的荧光值。计算背景对照3个重复的平均荧光值,将各梯度Lambda DNA标准品的荧光值减掉背景对照的平均荧光值,得到净荧光值。计算各梯度净荧光值的平均值和标准偏差 SD。以Lambda DNA 标准品 DNA量(ng)为 X轴,以各梯度净荧光值的平均值为Y轴,标准偏差 SD为Error 值进行多项式拟合分析.制作工作曲线,从中获得净荧光值与双链 DNA浓度的关系曲线如下,R2≥0.98:
y =A+Bx……(A.2)
式中∶
y——荧光值;
x——双链DNA的量,单位为纳克(ng)。
A.5.2 聚合反应新生成的双链 DNA量的计算
选取Excel文件中待检 Taq DNA聚合酶的第30 cycles 的荧光数据。首先计算空白对照3个重复的平均荧光值,将各梯度 Taq DNA 聚合酶的荧光值减掉空白对照的平均荧光值,得到净荧光值.计算各梯度净荧光值的平均值(y1)。将各净荧光值代入式(A.1)计算聚合反应新生成的双链 DNA量(x1)。
A.5.3 各 Taq DNA 聚合酶梯度条件下的 dNTP消耗量计算
各 Taq DNA 聚合酶梯度条件下的 dNTP消耗量以y。表示,单位为纳摩尔(nmol).按式(A.3)计算∶
y2=x1/(2×324.5)……(A.3)
式中∶
x1——新生成的双链DNA 量.单位纳克(ng)
2 —双链DNA由2 条单链 DNA组成;
324.5 —dNTP的相对平均分子质量。
A.5.4 Taq DNA聚合酶活计算
Tag DNA聚合酶酶活以S表示,单位为 U/mL。选择在0.024 nmol~0.166 nmol范围内的 dNTP 消耗量按照式(A.4)计算∶
S=(y2+0.03)×D/0.24……(A.4)
式中∶
y2——dNTP消耗量,单位纳摩尔(nmol);
D——酶的稀释倍数。
4.2.2 制定TaqDNA聚合酶核酸外切酶活性的检测方法
B.1 原理
cccpUC19 所含经 BamH I位点居于编码Lac Z的α互补肽上,cccpUC19经 BamH I酶切后,由环形 DNA结构形成稳定的具有至黏性末端的双链 DNA.其末端突出部分由五个碱基形成单链.极易受核酸外切酶作用。若样品存在核酸外切酶时,黏性末端易受外切酶切割,再经 T4DNA 连接酶连接,其电泳条带位置不一致。
B.2 仪器和设备
B.2.1 恒温水浴槽。
B.2.2 台式离心机。
B.2.3 超净工作台。
B.2.4 电泳仪。
B.3 材料
B.3.1 高纯ccc pUC19 DNA。
B.3.2 T4 DNA连接酶。
B.3.3 氯仿-异戊醇(24:1,体积比)。
B.3.4 琼脂糖。
B.4 实验步骤
B.4.1 长时程过量酶切
各取5 μg 高纯 ccc pUC19 DNA 置于两只 eppondorf 管,分别标记阴性对照和测试管,在阴性对照管里加入 10 μL 10×BamH I缓冲液.2 μL 限制性内切酶 BamH I(10 U~20 U),加入纯化水至100 μL;在测试管里加入 10 μL 10×BamH Ⅰ缓冲液,2 μL 限制性内切酶 BamH I(10 U~20 U),5 μL TaqDNA聚合酶样品(50 U~100 U),加入纯化水至 100 μL。混匀,37 ℃水浴 10 h,各取出20 μL,分别标记1,2号,待电泳检测;再各取20 μL,分别标记3,4号。
B.4.2 电泳
B.4.2.1 取出1号和2号管,加入载样缓冲液,准备电泳检测。
B.4.2.2 1%~1.5%琼脂糖,电冰电压5 V/cm~10 V/cm;当浪酚蓝线到达凝胶板 2/3时停止电泳,取出凝胶板置于紫外透光分析仪观察和拍照。
B.4.3 连接
B.4.3.1 回收 DNA
取出3、4号管,各加入 20 μL氯仿-异戊醇先脱去杂蛋白,再沉淀出 DNA,并真空干燥样品。
B.4.3.2 连接反应
每管加入2 μL 10×T4 DNA连接酶缓冲液,2 U T4 DNA连接酶,加入纯化水至20 uL,混匀,15℃水浴8 h。
B.4.3.3 电泳
B.4.3.3.1 取出3号和 4号管,加入载样缓冲液,准备电泳检测。
B.4.3.3.2 1%~1.5%琼脂糖;电泳电压5V/cm~10 V/cm;当溴酚蓝线到达凝胶板 2/3时停止电泳,取出凝胶板置于紫外透光分析仪观察和拍照。
B.5 结果判定
在电泳板上,肉眼观察。若1号和2号的谱带一致,3号和4号的谱带一致,则判定样品中不含核酸外切酶;若1号和2号的谱带不一致或(和)3号和4号的谱带不一致.则判定样品中含核酸外切酶。
4.2.3 制定TaqDNA聚合酶核酸内切酶活性的检测方法
C.1 原理
pUC19质粒为环状结构,核酸内切酶能破坏环状结构,两者电泳谱带不一致。
C.2 仪器
C.2.1 电泳仪。
C.2.2 分析天平(万分之一)。
C.2.3 紫外透光分析仪。
C.3 实验步骤
C.3.1 pUC19 质粒反应
C.3.1.1 在测试管里先后加入4 μLpUC19质粒DNA(1μg/μL)、14 μL纯化水、2 μL 酶,振荡器混匀,水浴1h;
C.3.1.2 在对照管里先后加入4 μL pUC19质粒 DNA(1 μg/μL)、16 μL 纯化水,振荡器混匀,水浴1 h。
C.3.2 电泳
1%~1.5%琼脂糖凝胶,电泳电压5 V/cm~10 V/cm,当溴酚蓝线到达凝胶板 2/3时停止电泳,取出凝胶板置于紫外透光分析仪观察和拍照。
C.4 结果判定
在电泳板上,肉眼观察。若测试管和对照管的谱带一致,则判定样品中不含核酸内切酶;若不一致,则判定样品中含有核酸内切酶。
4.2.4确定TaqDNA聚合酶质量标准及验收指标
4.2.4.1 外观
澄清透明的液体,无沉淀。
4.2.4.2 酶活力
按4.2.1的要求检查,酶活力≥200 U/μL。
4.2.4.3 杂质
按4.2.2和4.2.3的要求检查,不应含有核酸外切酶和核酸内切酶。
4.2.5TaqDNA聚合酶的选择
按上述要求检测结果如下:


结论:在其他指标满足要求的前提下,C厂家酶活力更好,选择C 厂家作为供应商,A厂家作为备用供应商。
4.3 DNA引物及探针的选择及质量标准的制定

4.3.1 制定DNA引物及探针的检测方法
除非另有说明,在分析中仅使用分析纯试剂,水为 GB/T 6682规定的一级水。
4.3.1.1 外观及性状
感官判断。
4.3.1.2 合成 DNA 的总量检测
4.3.1.2.1 测定吸光度
利用紫外分光光度计测定合成DNA产品的 OD,利用吸光度 A 等于1为1OD单位来计算合成DNA产品的总量。重复测定3次,结果取平均值。
4.3.1.2.2 试验方法
按照GB/T30988执行。
4.3.1.3 核酸引物探针相对分子质量的检测
4.3.1.3.1 相对分子质量的直接计算
相对分子质量可根据引物探针合成单.按照下式直接计算。
MW=(A×313.21)+(C×289.18)+(G×329.21)+(T×304.19)-61.94
式中∶MW
—相对分子质量;
A、C、G、T—各碱基对应的碱基数。
注:计算探针相对分子质量时,应加上相应的修饰基团相对分子质量。常见修饰基团相对分子质量参见GB/T34797表A.1。
4.3.1.3.2 质谱测定相对分子质量
采用ESI源电离喷雾技术,负离子模式将样品转化为运动的带电气态离子碎片,按质核比(m/z)大小分离并记录,通过换算测得相对分子质量。HPLC和 MS的设备及流动相参数参见GB/T34797附录 B。
4.3.1.3.3 测定结果
采用4.3.1.3.2方法测得的相对分子质量与4.3.1.3.1中计算的相对分子质量相对误差应小于或等于0.05%。
4.3.1.4 碱基准确性检测
产品序列和定制引物或定制探针序列的匹配程度,此序列由合成仪后台自动生成并验证。
4.3.1.5 碱基缺失率
通过质谱联用仪对合成的寡核苷酸序列进行测定,计算扣除目标峰以外的其他峰高占所有峰高的比值。
4.3.1.6 引物探针的纯度检测
4.3.1.6.1 质谱法
采用6.3.2 的方法测定,计算目标峰面积占所有峰面积比值得出纯度。
4.3.1.6.2 高效液相色谱法
采用高效液相色谱进行纯度测定,具体条件参见GB/T34797附录B,计算峰面积,并与对照进行比较,得出引物探针纯度。纯度应符合表3的要求。
4.3.1.7 探针修饰基团的准确性
4.3.1.7.1 质谱法
采用6.3.2的方法测定,通过比较相对分子质量来确定是否含有定制探针的修饰基团。
4.3.1.7.2 荧光光谱法
采用荧光光谱仪,固定激发波长,并以激发波长为起始点对发射波长进行扫描(起始点至 900 nm),验证修饰基团的准确性。对应修饰基团的特征吸收峰参见GB/T34797表C.1。
4.3.1.8 引物探针验证
4.3.1.8.1 总则
选择目标产品 DNA作为阳性对照,以非目标产品 DNA作为阴性对照:以灭菌去离子水为空白对照,进行 PCR 扩增(或实时荧光 PCR)试验,根据扩增结果判断试验效果。特异性验证试验应符合GB/T19495.1 的要求。
4.3.1.8.2 特异性和符合性判断
根据扩增图谱查看是否获得特异性条带(或是否有典型扩增曲线)。获得特异性条带(或有典型扩增曲线),即可判断产品符合要求,引物设计合理。
4.3.1.8.3 引物二聚体带
观察 PCR 扩增产物图谱未形成明显的引物二聚体带,空白对照和阴性对照未出现扩增现象,即可判断产品质量合格,引物设计合理。
4.3.4确定引物及探针质量标准及验收指标
4.3.4.1DNA引物探针产品质量控制指标及技术要求应符合表3的规定。
表3 DNA引物探针产品质量技术要求


4.3.4.2 外观及性状
产品应为半透明或不透明的片状粉状物质、无异味,易溶于水和 TE 缓冲液。
4.3.4.3 引物探针的总量
引物探针的总量一般以OD来表示,合成产品OD测量值与定制序列OD值作比较,要求总量相对误差≤10%。
4.3.4.4 引物探针的相对分子质量
测得的引物探针相对分子质量(MW)与定制序列 MW 值作比较;要求相对分子质量相对误≤0.05%。
4.3.4.5 碱基准确性(DNA序列的一致性)
将合成的引物探针序列与定制序列进行比对,匹配度应达到100%。
4.3.4.6 碱基缺失率
合成产品碱基缺失率应符合表3要求。
4.3.4.7 引物探针的纯度
引物探针纯度主要级别分为"脱盐"级、"过柱"级、PAGE 级、HPLC级,应满足表3要求。
4.3.4.8 探针修饰基团的准确性
探针修饰基团定制序列应完全一致。
4.3.4.9 试验效果评估
将合成以后的引物探针进行PCR扩增以对其试验效果进行评估,应有特异性条带(或有典型扩增曲线),观察 PCR扩增产物图谱未形成明显的引物二聚体带,空白对照和阴性对照未出现扩增现象,即可判断产品质量合格,引物设计合理。
4.3.5DNA引物及探针的选择
4.3.5.1审查供应商合成报告单,满足要求。
4.3.5.2用欧盟Certified Reference Materials:ERM®-AD623a, ERM®-AD623b,ERM®-AD623c,ERM®-AD623d, ERM®-AD623e,ERM®-AD623f(plasmid DNA containing a BCR-ABL b3a2 transcript fragment)进行验证。
标准物质浓度如下:


质粒图谱如下:




结论:在其他指标满足要求的前提下,A厂家灵敏度更高,选择A 厂家作为供应商。
4.4质控品原料选择及质量标准的制定

4.4.1实验目的:确定合适的BCR/ABL和ABL细胞系。
4.4.2 试验仪器
仪器:离心机、移液器、低温高速离心机、恒温水浴锅、数字 PCR 仪(型号:QX200 droplet reader, IVD),BIO-RAD公司生产;
4.4.3 耗材与试剂
耗材:1000ul枪头、200ul枪头、10ul枪头、EP管。
试剂:美国Bio-Rad的BCR-ABL数字PCR法试剂盒(QXDx BCR-ABL %IS Kit),不同厂家的K562细胞系,HL60细胞系。
4.4.4质量标准:K562细胞系融合基因浓度:>40%IS,HL60细胞系细胞系融合基因浓度:<0.002%IS。
4.4.4 实验步骤
将K562细胞系、KL60细胞系按试剂盒的要求提取RNA,反转录,数字PCR反应并进行数据分析结果如下:
K562细胞系检测结果如下:


BCR-ABL阴性细胞系检测结果如下:


结论:从结果看,A、C公司的K562细胞系、KL60细胞系均满足质量标准,由于A公司K562细胞系融合基因mRNA浓度最高,将其作为原料供应商。
五、 原材料研究总结

综上所述:
反转录酶选择选择****公司;引物和探针选择****公司;TapDNA聚合酶选择****公司;K562细胞系、KL60细胞系选择****有限公司。
详细原材料清单请见附件1。
附件1: 原材料清单
序号原辅料名称
1逆转录酶(c-MMLV酶)
2反转录酶
3RNasin
4逆转录引物:随机六核苷酸引物
5热启动TaqDNA聚合酶
6BCR-ABL 引物和探针
7ABL 引物和探针
8去核酸酶水
9K562 cells
10HL60 cells

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