基因编辑的概念和主要技术原理是什么？

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基因编辑的概念和主要技术原理是什么？
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干货分享：基因编辑操作步骤及详细说明 - 黄晓生的文章 - 知乎
黄晓生：干货分享：基因编辑操作步骤及详细说明可以看一看

长长的路

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武汉枢密脑科学技术有限公司一、CRISPR-Cas技术是什么？

CRISPR/Cas系统是一种原核生物的免疫系统，用来抵抗外源遗传物质的入侵，比如噬菌体病毒和外源质粒。同时，它为细菌提供了获得性免疫：这与哺乳动物的二次免疫类似，当细菌遭受病毒或者外源质粒入侵时，会产生相应的“记忆”，从而可以抵抗它们的再次入侵。CRISPR/Cas系统可以识别出外源DNA，并将它们切断，沉默外源基因的表达。这与真核生物中RNA干扰（RNAi) 的原理是相似的。正是由于这种精确的靶向功能， CRISPR/Cas系统被开发成一种高效的基因编辑工具。在自然界中，CRISPR/Cas系统拥有多种类别，其中CRISPR/Cas9系统是研究最深入，应用最成熟的一种类别。
CRISPR/Cas9是继锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。凭借着成本低廉，操作方便，效率高等优点，CRISPR/Cas9迅速风靡全球的实验室，成为了生物科研的有力帮手。
二、CRISPR-Cas9技术原理

CRISPR由一系列短的高度保守的正向重复序列（repeat）与长度相似的间隔序列（spacer）间隔排列组成。Cas基因是一类基因家族，编码的蛋白质具有与核酸结合的功能以及与核酸酶、聚合酶、解旋酶等结合的活性。根据Cas 基因的不同，将CRISPR-Cas9系统分为Ⅰ－Ⅲ 3种类型。在Ⅰ型 与Ⅲ型CRISPR-Cas9系统中，pre-crRNA 初级转录本被CRISPR相关RNA 酶切割成重复序列，释放小的成熟crRNA。成熟crRNA再与相关蛋白质结合形成RNA-蛋白质复合体指导内切核酸酶对外源DNA 序列的识别与降解。Ⅱ型CRISPR-Cas9系统是目前最常用于人工基因组编辑的CRISPR-Cas9系统。根据Cas蛋白的类型不同分为3个亚类：Ⅱ-Ａ型含有Cas1、Cas2、Cas9 和Csn2蛋白质；Ⅱ-Ｂ型含有Cas1、Cas2、Cas4 和Csx12 样Cas9 4种蛋白质；Ⅱ-Ｃ型则有Cas1、Cas2 及Cas9３种蛋白质。其中，Ⅱ 型CRISPR-Cas9 系统最早在改造后用于小鼠和灵长类基因组编辑，是目前研究最为充分的系统。它只需要单独的Cas9蛋白即可在gRNA（guide RNA）的引导下完成对DNA的定点切割。Cas9 蛋白行使功能需CRISPR转录而来的crRNA 与反式激活的及与CRISPR重复区互补的tracrRNA（trans-activiting crRNA，tracrRNA）形成的复合物参与。
为了操作简便，研究者将crRNA和tracrRNA 融合进同一条单链中，设计出单链引导RNA（single guide RNA，sgRNA）。在sgRNA的指导下，Cas9定位于特定DNA序列上，进行DNA双链切割，实现基因组的定向编辑。对靶序列有效的切割还需靶序列相邻的原型间隔序列毗邻基序，即PAM（protospacer-associated motif）的参与。PAM提供两个冗余的检查点，确保Cas9不会错误地破坏它自身的基因组DNA。CRISPR-Cas9基因组编辑技术的基本原理为将tracrRNA：crRNA设计为sgRNA，sgRNA包含位于５′端的靶DNA的互补序列，以及位于３′端的tracrRNA：crRNA的类似序列，crRNA 或sgRNA包含一个20nt指导序列可以直接匹配的靶位点，利用靶DNA的互补序列来定位需编辑的位点，利用tracrRNA：crRNA的类似序列与Cas9结合，实现目标基因定向基因组改造。



图1. CRISPR-Cas9基因组编辑技术的基本原理

三、CRISPR-Cas9应用



四、CRISPR-Cas9技术优势

1. 效率高：可精确编辑基因组，编辑效率高；
2. 周期短：构建和使用极为方便，极大降低了实验难度，缩短实验周期；
3. 广谱性：无基因、细胞及物种限制；
4. 多重编辑能力：可实现多个靶位点同时进行基因打靶；
5. 功能丰富：可实现敲除、插入、抑制、激活等多种目的基因.
五、CRISPR-Cas9基因编辑服务步骤




六、服务项目周期

清风寡欲

公开资料显示，基因编辑有望为目前无法根治的遗传疾病带来永久治愈的可能性，其具有独特的、创造性的优势，有望实现“一次给药、终身起效”的持久效果。由于基因编辑改写了人体最深处的“代码”，因此基因编辑带来的改变可以持续影响未来人体的基因表达，达到根治的效果。


另据不完全统计，与基因编辑有业务相关的A股上市公司包括双鹭药业、南模生物、富邦股份、普利制药、安科生物 、赛升药业、普洛药业、川宁生物 、利民股份和药康生物等，具体如下：


值得注意的是，虽然基因编辑疗法是潜在“一劳永逸”的最先进治疗手段，但它们也有普遍的问题——贵。作为参考，虽然现在还没看到Casgevy的售价，但蓝鸟生物已经在第一时间宣布Lyfgenia的批发收购价格为310万美元。专门评估合理药价的NGO临床和经济审查研究所此前曾估计，Casgevy的价格可能要接近200万美元。除了药物可及性外，基因编辑中的“脱靶”——基因编辑工具除了预期靶标之外还切割了其他DNA片段的情况，也是可以预见但尚无确切案例的风险点。
<hr/>在做交易的过程中，一定要严格谨记以下10大铁律

1、炒股不是人生的全部，一定要做好事业、家庭、健康、学习和友情的平衡。炒股是手段，目的是为了你的人生更美好，很多人搞反了，整天沉迷炒股，无法自拔。
2、对大多数人来说，一份稳定的工作胜过股市的10个涨停，尤其是年轻人。很多人问我要不要全职炒股，除非你有500万以上且不愁生活开销，交易体系稳定，否则不要开这种玩笑。
3、不要使用杠杆，尤其是刚入市3年以内的朋友。这是一条不归路，随便一波单边，就可以把你消灭得干干净净，比如从2022年开年到现在这波下跌，无数资金灰飞烟灭。
4、好的身体，规律的生活是成功的前提。很多人说等我哪天成功了，我就开始规律生活、锻炼身体。大错特错，又搞反了！是因为你生活规律、身体健康才可能走向成功。
5、认清楚自己的能力圈，比你的努力更重要。俗话说，方向不对，努力白费。每天把精力浪费在自己不擅长的地方，不伤痕累累才怪呢！
6、用长期的心态来对待股市。炒股是一个好的行当，但绝不是你的提款机，尤其是短期的提款机。如果你以长期的眼光对待股市，股市也必将厚报于你。
7、在别人贪婪的时候，恐慌；在别人恐慌的时候，贪婪。这句话，我已经说烂了，但是好多朋友依旧不懂，比如最近的3000点下方，就是别人恐慌的时候。
8、永远只用闲置资金。炒股是资金的游戏，属于“有钱人”的活动，千万不要用救命钱，或者是生活费炒股，这会让你的心态扭曲。只有那些你3年不用的资金，才能用来炒股。
9、放松，如果自己觉得有压力，就不要做这件事，因为聪明人也干不好自己不喜欢的事。只有能够产生“心流”的工作，才能让你有所收获！对于你的持仓也是同理，明白吗？
10、炒股的目的，无非是通过股市实现资产的增值，过好这一生，这是由你的认知水平决定的。如果认知不行，那就不断提高自己的认知即可！否则，靠运气赚的钱，迟早会凭实力亏光！
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清风寡欲

分子诊断是应用分子生物学方法，通过检测受检个体或其携带病毒、病原体的遗传物质的结构或含量的变化而做出诊断的技术。其检测对象主要为核酸和蛋白质，以核酸分子为主，相比于发展成熟的免疫诊断、生化诊断等技术，分子诊断处于快速成长期，是体外诊断（InVitro Diagnosis,IVD）领域发展最快的细分领域，具有检测时间短、灵敏度更高、特异性更强等优势，被广泛应用于传染性疾病、血液筛查、遗传性疾病、肿瘤伴随诊断等领域。
分子诊断技术的发展经历了四个阶段：
（1）第一阶段：20世纪80年代基于核酸分子杂交技术的遗传病诊断；
（2）第二阶段：20世纪90年代聚合酶链式反应（PCR）的问世将分子诊断技术推向更精准、更高效的阶段特别是发展到第二代的荧光定量PCR（qPCR）和第三代的数字PCR（dPCR）；
（3）第三阶段是基于基因芯片的多指标、高通量基因检测；
（4）第四阶段是基于基因测序技术在NIPT（无创产前诊断）、遗传性肿瘤筛查及肿瘤精准治疗等方面的应用。




国内分子诊断起步较晚，发展速度高于全球。在精准医疗、个性化用药等需求推动下，分子诊断技术在全球得到飞速发展，根据火石创造数据显示，2013-2019年全球分子诊断市场规模由57亿美元增长至113.6亿美元，年复合增长率为12.18%，主要市场玩家包括罗氏、雅培、西门子、强生等。国内分子诊断虽然起步较晚，但在消费升级、政策扶持以及资本青睐等多重因素推动下，已经由产业导入期步入成长期。2013-2019年，我国分子诊断市场规模由25.4亿元增长至约132.1亿元，年复合增长率达到31.63%，虽然仅占全球市场规模的16.86%，但是增速约为全球增速的2.6倍，主要企业包括达安基因、凯普生物、华大基因、贝瑞基因、艾德生物等。




分子诊断领域主要包括PCR（qPCR和dPCR）、二代测序技术（NGS）、荧光原位杂交（FISH）、基因芯片等，其中PCR是目前应用最成熟、市场份额最大的技术平台，在国内分子诊断中市占率为40%，在国内获批的分子诊断产品中，基于PCR技术的超过90%。与杂交技术和测序技术相比，PCR技术主要优势在于高灵敏度、易于推广，主要局限在于检测位点单一且已知，多重基因联合检测时可涵盖的基因数量受限，目前已经发展到第三代数字PCR（dPCR），短期内仍将是分子诊断主流技术平台；测序技术发展迅猛，虽然市占率较低但市场增速最快，其中二代测序技术NGS（高通量测序）是目前测序领域应用最广泛的技术，已经成为许多序列变异分析与科研应用的主要选择，但由于实验操作复杂、成本高等原因，在临床应用中仍处于起步阶段，应用前景广阔。




FISH是一种利用非放射性的荧光信号对原位杂交样本进行检测的技术，主要用于指导肿瘤靶向药物使用、肿瘤预后、肿瘤疾病分型诊断等领域，是检测HER-2基因状态的金标准，目前在大多数省份和地区已经纳入医保。FISH全称荧光原位杂交技术，原理是利用已知的DNA变异序列，与被检测的样本DNA序列杂交、互补配对，从而发现样本DNA的异常情况，主要用于了解基因或染色体是否发生扩增、缺失、融合或断裂，检测样本来源广泛（组织、脱落细胞、羊水、血液、骨髓等），且不仅限于新鲜样本，2-3年的石蜡样本都可以检测；同时，FISH检测成本较低而且在大多数省份和地区都被纳入医保范畴。FISH应用最多的场景是DNA扩增检测，《2014年NCCN乳腺癌临床实践指南》和《乳腺癌HER2检测指南2014版》均指出FISH是检测HER2基因状态的“金标准”，目前Roche、Abbot等研发的HER-2扩增检测试剂盒已获得FDA批准。




基因芯片技术又称DNA微阵列技术，是将大量已知DNA序列做成探针，集成在同一芯片上与标记样品分子进行杂交，从而获得样本序列信息，可以实现对大量目标基因同时进行检测，具有成本相对较低（比如微基因的WeGene检测套件仅599元）、检测效率较高的优势，主要应用于消费级基因检测、病毒分型、耐药突变位点检测、遗传基因和肿瘤基因检测等领域。相比基因芯片产业在发达国家的高速发展，我国基因芯片行业市场尚处于起步阶段，代表企业包括赛乐奇、博奥生物、百奥科技、达安基因等，目前获批的基因芯片诊断试剂盒主要应用在HPV病毒基因分型、乙肝病毒基因分型和耐药突变位点检测、肿瘤基因突变等领域，获批的基因芯片相关仪器较少。在国家相关政策和终端需求不断扩大的推动下，我国基因芯片技术已经进入产业化探索阶段，根据沙利文数据显示，中国基因芯片行业市场规模从2014年的35亿元增长至2018年的95.1亿元，年复合增长率为28.4%。




测序技术更迭速度快，二代高通量测序（NGS）为市场商用主流。从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）发展至今，测序技术经历了第二代高通量测序（NGS）、第三代单分子测序技术和第四代纳米孔测序技术的发展变革，各代技术应用领域不尽相同，各有优缺点，目前处于三代技术并存的局面。第一代Sanger测序技术具有测序读长较长、准确率高的优点，但由于通量低、成本高等因素没有得到大规模应用；二代测序技术自2005年以来快速发展，凭借高通量、低成本、测序时间端等优势，在全球测序市场中仍占据主导地位；第三/四代技术在测序流程、测序时间和读长上进一步优化，在ctDNA测序、单细胞测序等也具有明显优势，是未来发展趋势，但目前由于错误率较高、分析软件不够丰富等原因，商用受到一定限制，未来随着技术的改善有望进入成熟应用阶段。
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高通量测序技术（NGS）又称为下一代测序技术，是指通过模板DNA 分子的化学修饰，将其锚定在纳米孔或微载体芯片上，利用碱基互补配对原理，在DNA 聚合酶链反应或DNA 连接酶反应过程中，通过采集荧光标记信号或化学反应信号，实现碱基序列的解读，一次性可完成几十万至上百万条序列的测定。NGS 技术可提供满足评估目标靶向基因所需的扩展性、速度和分辨率。可以同时对许多样本中的多个基因进行评估，如此便可运行多个独立的分析，从而节省时间并降低成本。另外，与范围更广的方法（如全基因组测序）相比，靶向基因测序生成的数据量更少，更易管理，因而分析起来更加轻松。




多因素驱动NGS市场高速发展。随着NGS技术进步和测序成本的降低、肿瘤医生和病人对NGS检测认知不断完善、测序服务对象和应用细分领域的拓展、企业间合作的增加，NGS有望迎来快速发展。根据美国Markets  and  Markets报告显示，预计全球高通量基因测序市场规模将从2019年的78亿美元增加至2025年的244亿美元，CAGR为20.9%。


NGS在NIPT领域应用最成熟，肿瘤早筛、个体化用药等前景广阔。与其他分子诊断技术相比，NGS技术具有通量高、准确度高、可以多重检测、所需样本量少等优点，在医学研究及临床检测中得到广泛应用和推广，主要包括无创产前检测（NIPT）、胚胎植入前遗传学诊断/筛查（PGD/PGS）、遗传病诊断、肿瘤诊断和个性化治疗、致病基因检测、病原微生物检测等：
（1）无创产前检测（NIPT）：是NGS临床应用最为成熟的领域，国内NIPT检测价格大多在800-2400元之间，深圳、天津等地区已经将NIPT纳入医保，未来随着价格不断降低以及对NIPT认知度提升，渗透率或稳步上升。国内目前共10个基于NGS的NIPT检测试剂盒获批上市，其中华大基因和贝瑞基因先发优势明显，占据70%的市场份额，形成双寡头竞争格局。国外代表公司包括美国Sequenom、Natera、Verinata和Ariosa以及欧洲的LifeCodexx。
（2）胚胎植入前遗传学诊断/筛查（PGD/PGS）：PGD/PGS是指在辅助生殖过程中，对胚胎进行种植前的活检和遗传学分析，以选择无遗传学疾病的胚胎植入子宫。相比传统的FISH和PCR技术，NGS最大的优点在于它不仅可以检测胚胎的非整倍体，还能检测单基因遗传疾病，目前该领域仍处于探索阶段，国内仅有苏州贝康的胚胎植入前染色体非整倍体检测试剂盒（半导体测序法）于2020年2月获批上市，另外华大基因、中仪康卫、贝瑞基因、安诺优达等也在积极推进其胚胎植入前检测产品的上市。PDG/PGS在辅助生殖领域的应用价值越来越明显，未来随着测序成本降低和更多产品获批，市场需求有望持续扩大，或成为继NIPT之后NGS在生育健康领域新的“蓝海”市场。
（3）肿瘤领域：伴随诊断、肿瘤早筛和药物研发是NGS检测在肿瘤领域应用的三大场景，其中伴随诊断是当前肿瘤NGS检测最主要的应用领域（超过95%），2018年燃石医学拿到“国内肿瘤NGS检测试剂盒第一证”，此后艾德生物、世和基因和诺禾致源的肿瘤NGS检测试剂盒相继获批。根据灼识咨询报告显示，在中国NGS癌症治疗方案提供商市场的医院细分市场中，按检测患者人数计，燃石医学2019年市场份额达到79.9%，先发优势明显。在肿瘤早筛领域，目前主流技术液体活检仍存在一定局限性。
（4）感染性疾病病原体检测：在病原微生物检测方面，NGS检测具有独特的优势，不受限于传统PCR技术需要利用已知物种的DNA序列设计PCR引物探针，可实现对未知的疾病相关的微生物快速鉴定，目前已经成功应用于H1N1病毒基因组的发现和结核杆菌分子分型等。但目前NGS在微生物领域应用仍处于方法学的标准品验证阶段，全球尚无该领域的检测试剂盒获批，应用前景值得期待。


分子诊断技术应用场景多样化，不同技术各有优势。在实际应用中，针对每种特定的应用场景，往往需要综合考虑患者治疗过程、不同癌症的采样方式和病例组织形态、患者身体状况和经济水平等因素来决定使用哪种诊断手段。不同平台各有优势，未来3-5年呈现长期共存、相辅相成的局势，以不同突变基因和突变类型为例：
（1）HER2扩增或过表达：对HER2基因表达的检测办法可以采用FISH、IHC、CISH等，一般来说，实验室首先采用IHC方法进行HER2蛋白检测，如果检测结果为2+，则使用FISH技术进行HER2基因检测确认；
（2）染色体片段微缺失微重复（CNV）：基因芯片技术对片段微缺失微重复（CNV）具有较好的检验结果，而目前测序较难对CNV 进行准确的检测；
（3）ALK基因扩增和ROS1基因融合：FISH是目前使用的主流技术。


一些特定基因检测往往需要结合多个诊断手段，提高检测准确率。以ALK基因检测为例，根据《中国非小细胞肺癌ALK检测临床实践专家共识》，Ventana-D5F3 IHC、FISH、RT-PCR、NGS四种技术均可用于ALK 基因融合检测，但没有一种方法可以保证100%准确率，在检测时需要根据具体情况结合多个技术以避免出现漏检、错检的问题。




NGS近些年发展迅速、异军突起，广阔的市场应用前景吸引大量企业争相入局，叠加资本市场季度青睐，NGS迎来井喷式发展，市场普遍认为NGS终将会取代以PCR为主导的传统分子诊断技术平台，企业布局NGS一定比PCR更具有未来。但根据我们的观察和分析，我们认为PCR技术和NGS技术优势互补，分别满足不同场景的临床检测需求，将在相当长的一段时间内优势互补、共同发展。
分子诊断产业链由上游的设备和试剂、中游的基因测序服务、下游的医院等需求终端组成：
上游诊断试剂和仪器供应商：国内分子诊断试剂发展较为迅速，基本已经实现国产化；诊断仪器领域，国产仪器占比较小，其中核酸提取仪、普通PCR仪、基因芯片仪、分子杂交仪等技术相对容易攻破的中端仪器领域基本已经实现国产替代化，而包括数字PCR仪和基因测序仪在内的高端仪器主要由外资品牌主导，技术壁垒极高，国产品牌正处于起步阶段。数字PCR仪目前市场上基本被Bio-Rad、Thermo Fisher、StillaTechnomogies国际大品牌所占有。基因测序仪领域基本被Illumina、Thermo Fisher、Rocher等外资品牌垄断，目前国内仅有华大基因等个别优秀国产品牌实现了自主研发生产的基因测序仪，大多数企业是通过OEM（贴牌）和合作研发的形式完善产业链布局。
中游测序服务供应商：国内基因测序服务竞争激烈，企业众多。国内基因测序服务提供商普遍对上游仪器和试剂供应商依赖严重，绝大部分厂商不具备自主研发基因测序仪和和核心试剂的能力，议价能力弱。华大基因从基因测序服务为切入口，目前已经发展成全球最大的基因测序机构，同时还拥有自主研发的基因测序仪，是国内为数不多的布局基因测序上中下游产业链的企业之一。
下游需求市场：分子诊断产业链下游是为患者提供医疗服务的机构，包括医院、第三方医学检验服务机构、科研机构、药企等。与发达国家相比，我国独立实验室发展较晚，市场规模小，占医学诊断市场比例低，其中检测项目以普检为主，高端检测比例低。


相比传统血清学唐筛，NIPT扩大检测时间窗口，安全性、特异性、敏感性大幅提高。孕妇产前筛查和产前诊断不同，前者的目的是在健康人群中筛查出高风险孕妇，进而通过羊水穿刺、脐带血穿刺等侵入性诊断方法进行确诊，从而避免21三体综合征等胎儿遗传病的发生。目前我国临床上针对染色体非整倍体的筛查手段包括超声检查、血清学唐氏筛查和无创产前DNA检测（NIPT），前两种方法存在较高的假阳性率和漏诊率，血清学唐氏筛查作为传统的产前筛查手段，根据孕周大小分为早期筛查（9-13周）和中期筛查（15-20周），早孕期联合超声波NT的唐筛筛查染色体异常的检出率约为70%-80%，中孕期筛查的检出率约为65%-70%，仍存在明显不足。高特异性的NIPT很好地弥补了这两种方法的缺陷，已有报道显示，NIPT应用于染色体非整倍体异常胎儿检测的敏感性为91.7%-100%，特异性为97.9%-100%。NIPT检测时间窗口较宽，适用于孕12-26周，早于12周孕妇血中胎儿DNA含量较低，可能会导致检测存在误差。




NIPT以高通量测序（NGS）为主，具有无创、检出率高、流产风险低等优势。基于母体外周血胎儿游离DNA（cfDNA）和高通量测序（NGS）等技术的无创产前检测（NIPT）是基因测序在生育健康领域的重要应用，检测原理是通过采取孕妇静脉血，利用高通量测序技术（NGS）对母体外周血浆中的游离DNA片段（包括胎儿游离DNA）进行测序，并将测序结果进行生物信息分析、从中得到胎儿的遗传信息，从而检测胎儿是否有染色体异常的疾病，主要用于3种染色体数目异常遗传疾病：21三体综合征（唐氏综合征）、18三体综合征（爱德华氏综合征）、13三体综合征（帕陶综合征）。NIPT具有无创、检出率高、漏诊率低、检测周期短、流产风险低、操作简便等多方面优势：（1）NIPT只需抽取5-10ml母体静脉血，属于非侵入式检查，从而避免了流产风险和宫内感染的可能性；（2）基于NGS的NIPT检测准确率较高，其中对于21三体综合征的检出率达到99%以上，且怀孕12周即可接受NIPT，能够尽早发现问题、及早预防。




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基因编辑从狭义的概念上来说，就是在特定靶位点对基因序列进行突变。
基因编辑的核心是如何在DNA双链上形成DSBs（double strand breaks）进而引发生物体基因组的自主修复机制。这样的修复机制有两种：当没有模板基因的时候引发的是NHEJ修复途径，这样的修复途径相当不精确，有很大的几率产生插入缺失突变，造成整个基因发生移码突变，从而失去原有的功能。这样的基因编辑我们通常称之为基因敲除（knock-out）。当存在修复模板的时候（通常是我们要转入的基因两端加同源臂）生物体就会启用另外一种修复途径HDR，这种途径会按照模版来修复基因序列，就可以将我们设计的外源基因插入到目的位点。这样的基因编辑我们称之为基因敲入（knock-in）。现在主流的基因编辑技术基本就是ZFNs/TALENs和CRISPR/Cas9技术。新开发哦的CPF1或者NgAgo基本还在探究阶段没有大范围的用于具体的研究过程。