药物排泄研究中粪便样品分析的挑战

Rose

在药物的体内药代动力学研究中，药物排泄是非常重要的研究内容，与药效、药效维持时间和不良反应息息相关。药物的排泄方式主要有肾排泄和胆汁排泄，除此还有粪便、乳汁、唾液和汗液排出等。而在PK研究中排泄样品主要来源于尿液、胆汁和粪便。粪便中的药物主要有3个来源：口服未经吸收的药物；经胆汁排泄进入小肠的药物；由肠黏膜分泌进入肠道的部分。对于粪便中药物代谢研究的主要意义有以下几点：通过检测粪便中原型及代谢产物的浓度，评估药物的排泄情况，更好的了解药物的去向；监测代谢产物的暴露量，评价药物的潜在安全性等。
本文以粪便的组成成分为基础，阐述了粪便样品分析前处理的诸多挑战，如储存、匀浆、回收率等，并针对性的提出了相应的分析策略。
一、粪便的主要成分

一般而言，如表1所示，粪便主要成分是水，大约占66%，食物残渣，无机盐和微生物等固体成分占34%。与血浆和脑组织相比，粪便中的食物残渣，无机盐和微生物含量要多很多，而蛋白含量则相反。除此以外，粪便中各主要成分的占比不是一个固定值，常常受肠道环境和食物组分的影响。这些成分上的特点，给生物分析带来独特的挑战。
表1. 粪便、血浆和脑的组成分析[1][2]

粪便a	血浆b	脑b
水	66	90	77
食物残渣	9	NA	NA
无机盐	7	＜1	＜1
微生物	10	NA	NA
脂类	7	＜1	11
蛋白	1	8	8

a质量百分比 (%)；b体积百分比 (%)
二、粪便样品的收集与储存

粪便样品不仅成分复杂，而且还极易受到外界环境的影响。温度适宜时，粪便中的微生物会发酵，可能使得粪便中的药物发生变化，例如在粪便局部厌氧的环境中，可能发生催化还原、水解等反应。Zimmermann等[3]系统评估了76个肠道菌株对271种口服药物的化学修饰能力，发现2/3的药物至少被一种肠道菌株代谢，且发现单一菌株具有广泛的代谢能力，能够代谢11~95种药物。虽然大部分微生物经肠道排出体外时已经失活，但部分仍具有活性，那么对未知化合物的稳定性就是一个巨大的威胁。
在PK实验中，粪便样品分时间段收集，那么在收集的过程中对待测物是否有影响？Gratton等人[4]调查了储存温度和持续时间对粪便代谢谱的影响，结果表明，新鲜粪便样本在运输过程中应保持在4℃或者湿冰上，最好在收集后1小时内进行样品匀浆处理，或最多在24小时内处理完毕，再进行冷冻储存（冻存）。如无条件立即进行匀浆处理，也可以考虑立即冻存新鲜粪便，以及以粪水或者冷冻干燥（冻干）的形式储存粪便。表2比较了这三种方法在储存方面的优缺点[5][6]。
表2. 三种处理方法在储存方面的优缺点分析

处理方法	优点	缺点
新鲜粪便立即冻存	1. 对实验条件要求低，更为普遍和实用	1. 解冻粪便后再匀浆可能会导致匀浆时难以均一化，导致分析偏差2. 反复冻融可能会导致化合物降解
粪水	1. 可直接进行下一步的LLE或SPE预处理	1. 因粪水含水比例大，不适用于疏水性强的化合物检测
冻干粪便	1. 可有效抑制微生物的繁殖2. 匀浆时，对于量多的样本可节约有机试剂	1. 挥发性化合物损失明显2. 如样品少于150 mg，冻干操作可能导致相对较高的偏差3. 相对于湿粪，提取物产生的背景噪音更高

鉴于以上的优缺点，建议在湿冰上收集粪便，新鲜粪便样本在储存前（即在收集后24小时内）进行匀浆处理，这样可以防止因解冻原始粪便引起的不均匀性。同时如条件允许，建议在冻存前进行分装，可尽量减少冻融循环次数。
三、粪便样品匀浆

由于粪便基质的高度复杂性和异质性，粪便样品制备是一项艰巨的任务。针对食物残渣难以打碎、样品难以均一化这一特点，优化匀浆方法可以将样品中的化合物能更好的渗透到匀浆液中。目前文献报道的匀浆方法有机械粉碎和超声粉碎[5]，其中机械粉碎是最常使用的匀浆方法，主要设备有手持式高速搅拌匀浆器（图1）和Bead-beater研磨珠均质器（图2），后者可以适用于通量操作。此外，样品的颗粒物会影响测定样品值的准确性，在进行前处理取样时，使用较大的取样体积可一定程度上消除匀浆均一性不佳带来的影响。


匀浆液的组成和比例也是决定提取方法重现性的重要因素[5]。甲醇和乙腈是最常用的有机匀浆液，此外，匀浆液的pH值也会影响方法的重现性。pH值的变化可能会导致化合物的水解，而且不同化合物的电荷会随pH值而变化，没有一个适合所有化合物的理想pH值。因此，任何pH值调整都应考虑到目标化合物和实验目的。匀浆液与样品的比例直接关系到取样的准确性，匀浆比例加大后，体系的粘度降低，匀浆样品也更加均一（如图3所示）。



图3. 不同匀浆比例对比 (feces/buffer (w:v))  (a)1:5; (b)1:9; (c)1:14;

四、高含量的无机盐

回收率是生物分析方法中一个很重要的考察方面。食物残渣因吸附化合物对回收率有一定的影响，但当回收率极低时，就需要考虑其他因素。如表1所示，粪便基质中无机盐的含量高达7%左右，是因为经口摄入的无机盐吸收比例少而排出比例多，排除的部分就富集在粪便中。比如，钙的吸收比例只有20-30%，经粪便排出的则超过70%，而且其含量随钙的摄入量及肠吸收状态波动较大。这种情况下如果遇到化合物恰好有特殊的结构，就可能与钙镁等金属离子发生螯合，导致回收率极低。与金属离子螯合一般需要具备以下两个特征：1) 有两个或两个以上都能给出电子的配位原子（主要是O、N等原子）；2) 配位原子须间隔两个或三个其他原子，形成稳定的五元环或六元环。研究表明环数越多，形成的螯合物越稳定。鉴于以上反应机理，要解决回收率问题，可以选择加入螯合力更强的螯合剂，比如EDTA，让其竞争性地与Ca2+、Mg2+等金属离子螯合。例如：二膦酸盐是一类用于各类骨疾患及钙代谢性疾病的药物，容易与Ca2+生成螯合物[7]，但加入EDTA后就可将化合物置换出来（如图4所示），达到理想的回收率。Franziska等[8]在测定鸡粪中氟喹诺酮类化合物时发现EDTA的加入可以显著提高环丙沙星的回收率。



图4. 二膦酸盐和EDTA与钙离子的螯合示意图

五、粪便样品分析策略总结

综合以上表述，我们总结出了粪便样品分析前处理的策略。
储存
建议湿冰收集粪便，在收集完之后，在1 h之内完成样品的匀浆处理为最佳，如果不能则需要低温保存。
匀浆
对于样品匀浆，需要考虑匀浆方式、匀浆液的组成以及匀浆液与样本的比例，并且要全程保持低温，以保证化合物有良好的稳定性。可选择调节匀浆液的pH或使用高比例的有机溶剂作为匀浆液。
金属离子含量高
当待测物与金属离子螯合时，可加入鳌合能力更强的螯合剂将化合物置换出来，例如EDTA。



图5. 粪便样品分析策略

粪便样品的复杂性和个体差异性，决定了不同化合物之间的样品预处理难以得到统一的方法。对未知化合物而言，在满足项目需求的前提下，应选择最便捷、最经济的策略。
总结与展望

在药物的排泄研究中，药明康德药性评价部Non-GLP生物分析团队归纳出一整套的分析策略，能够帮助客户高效的完成实验，提供准确可靠的数据，助力客户的药物研发进程。我们拥有经验丰富的专业分析团队、先进的分析仪器设备、全流程信息化管理和可靠的质量管理体系，可持续赋能客户，高效、高质量地完成涵盖药物筛选到药品临床试验申报各阶段中生物发现、体内外药代动力学、药效学以及毒理学的生物分析服务。希望能为更多的药物排泄研究赋能助力，服务于全球更多的制药公司和研发机构，从而让更多的医药产品成功上市，造福更多的病患。
参考文献：
[1] Zulfi Hadianto et al. E3S Web of Conferences 73, 07011 (2018)
[2] H. McIlwain et al. Biochemistry and the central nervous system. Edinburgh: Churchill Livingstone, 1985
[3] Michael Zimmermann, et al. Nature, 2019, 570 (7762): 462-467
[4] Jasmine Gratton et al. Anal. Chem. 2016 (88): 4661-4668
[5] Jing Xu et al. TrAC_Trends_Analyt_Chem. 2019 (112): 161-174
[6] Naama Karu et al. Analytica Chimica Acta 2018 (1030): 1-24
[7] Adriana Bigi et al. J. Funct. Biomater. 2018, 9, 6; doi:10.3390/jfb9010006
[8] Franziska Januscha et al. Environ_Toxicol_Pharmacol. 2014 (38): 792-799作者：姜振华，郭立志，胡维民
编辑：曹卫群，方健，钱卉娟
设计：倪德伟
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