学术爆款“空间转录组技术”，都有哪些技术？ | 空间转录组学方法综述

乔帮主

空间转录组学的发展极大地扩展了复杂多细胞生物系统的知识。那么大家常常提到的空间转录组技术都有哪些技术？

今天小编分享的这篇发表在《BioEssays》的文献综述了现有的空间转录组学方法，讨论了它们的应用及其优缺点。


                                    本综述中提及的已发表方法的简要时间表


                                                    空间转录组技术的比较

基于微解剖基因表达的技术

捕捉空间基因表达信息的方法只是通过从样本中分离出目标区域，然后将这些区域单独放入试管中进行RNA提取和后续的基因表达谱分析。虽然解剖单个区域进行后续的测序可以完整地提取不同形式的RNA种类，实现同工型存在等分析，但一般来说，覆盖较大的区域通常很麻烦，而且在整个组织中获得整体情况往往是不可行的。


                                      基于微解剖基因表达的技术综述

激光捕获显微切割
激光捕获显微切割（LCM）是一种利用激光束在显微镜下切割组织区域的技术。2017年，LCM方案的一个扩展版本Geo-seq，将LCM与scRNA-seq相结合，以分析小到10个单细胞组织区域的转录组。

tomo-seq
2014年描述的一种叫做RNA断层扫描（tomo-seq）的冷冻切片方法通过线性扩增单个组织的cDNA。与早期的冷冻切片方法相比，这种方法在RNA定量和空间分辨率方面都有优势。然而，使用tomo-seq的转录组图谱只能用相同的生物样本构建，因此不能应用于临床样本。

TIVA
TIVA是一项能够实现活细胞空间转录组学的技术。它通过细胞穿透肽，将一个光激活的生物素标签引入活细胞中。通过对选定的区域或单细胞进行光激活，poly(U)序列暴露出来，并与细胞mRNA的poly-A尾退火。之后利用链霉亲和素与标签上的生物素相结合，可以收集捕获的mRNA，进一步用于RNA-seq。虽然它可以应用于活体组织，但它的主要限制是其通量低，一次只能分析少数单个细胞。此外，对活组织的应用限制了它在模型系统分析中的应用。

NICHE-Seq
NICHE-Seq在一个特定区域（组织内拥有特定微环境的区域）内，对单个细胞的转录组进行剖析。这项技术通量非常高，可以分析一个区域内的数千个细胞，但他们在光激活区域内的确切位置是未知的。由于目前的流程依赖于基因工程模型生物，它不能应用于人类样本。

ProximID
ProximID通过观察细胞之间的实际物理相互作用，通过在温和的条件下解离组织，从而保留包含两到三个细胞的小型相互作用结构来实现。然后手动微解剖和单个细胞作为主体进行scRNA-seq。然而，手动显微解剖使该技术有点劳动密集型，因此在通量方面是有限的。

原位杂交技术
不从组织内的各个部分（或细胞）中提取RNA分子，而是直接在其原始环境中对其进行可视化，这可以通过与感兴趣的目标互补的标记探针杂交来实现。


                                     原位杂交技术概述（不包括DNA显微镜）

单分子RNA荧光原位杂交法
原位杂交（ISH）利用标记的核酸探针来确定组织和细胞中DNA和RNA的空间位置和丰度。之后不断进化，形成了单分子RNA荧光原位杂交技术（smFISH）。smFISH利用多条短的寡核苷酸探针（大约20 bp）来靶向同一mRNA转录本的不同区域。2008年开发了一种替代性的smFISH方法，使用一组≈40个探针(20bp)，每个探针耦合到一个单一的荧光团。虽然smFISH具有高灵敏度和亚细胞空间分辨率，但由于标准显微镜中光谱重叠的固有限制，它一次只能针对几个基因。

seqFISH
seqFISH是一种多路smFISH方法，通过连续几轮杂交、成像和探针剥离，多次检测单个转录本。然而，杂交轮数的增加需要增加smFISH探针的数量，这使得seqFISH既昂贵又耗时。

MERFISH
为了弥补seqFISH的大量耗时，2015年发布了MERFISH技术。这种技术可以鉴定单个细胞中数千种RNA的拷贝数和空间定位。它利用组合标签、连续成像等技术来提高检测通量，并通过二进制条形码来抵消单分子标记和检测错误。2018年，MERFISH技术与扩张显微镜相结合，通过扩大RNA目标之间的距离，可以在没有光谱重叠的情况下使检测到的分子数量增加。

连续荧光原位杂交法
2019年，seqFISH的研究小组也采用了与MERFISH有些相似的方法，即使用包含侧翼区域的主探针一步定位，随后多次读取探针循环。该方法允许使用标准共聚焦显微镜的10000个基因的目标复用，而不需要超分辨率设备。然而，这种策略仍然是基于先验地决定目标，并且需要使用大量的合成探针集。

osmFISH
osmFISH是一种非条形码技术，osmFISH的靶点数量设置为杂交轮数，其中每一轮杂交包括一定数量的基因的探针集。每一轮杂交后，获得图像，然后去除探针，进行下一轮杂交。虽然osmFISH与其他smFISH技术相比具有较低的复用能力，但它在处理较大组织区域的能力方面表现突出。

RNAscope
2011年，Advanced Cell Diagnostics推出了商业化的RNAscope芯片。该检测的核心是探针设计，两个相邻的 "Z-probes "与目标RNA转录物结合，形成所需的结合位点，供后续的放大分子杂交使用。2019年7月，同时检测RNA靶点的最大数量增加到12个。低倍数RNAscope还与成像质粒细胞仪（IMC）相结合，用金属标签代替荧光团对DNA树进行杂交。随后，将金属结合的抗体添加到同一组织切片，并进行金属丰度的质细胞测量，允许同时进行RNA和蛋白质评估。

DNA Microscopy
2019年，提出了一种被称为 "DNA显微镜 "的核苷酸无光学图谱，它不依赖于从已知位置的物理捕获，而是依赖于热力学熵。与传统的成像方法相比，DNA显微镜的原理意味着一个相当奇怪的反向特征，信号的稀疏性成为挑战，而高信号密度意味着更容易重建。迄今为止，该技术只对培养细胞上的一小部分转录本进行了演示。

靶向原位测序技术

RNA测序可以直接对细胞中的RNA含量进行测序，而细胞仍处于其组织环境中。转录物的位置可以用亚细胞分辨率来解决，但为了达到足够的信号进行成像，需要使用微米或纳米大小的DNA球来放大信号。


                                                 靶向原位测序技术概述

使用挂锁探针进行原位测序
2013年，发表了第一个ISS方法，该方法使用挂锁探针来靶向已知基因。在完整的组织切片内，mRNA首先被逆转录为cDNA，挂锁探针可以结合到其上。挂锁探针是一种单链DNA分子，含有与目标cDNA互补的区域。虽然带有挂锁探针的ISS有利于亚细胞分辨率，但由于测序读出长度短和RCP的大小，目标数量有限。2019年，ISS检测在微流控平台上实现了自动化。

BaristaSeq
BaristaSeq是另一种基于缺口填充挂锁的方法，其读取长度增加到15个碱基。BaristaSeq展示了与传统的间隙填充挂锁ISS相比，RCP形成的定量增加了5倍，与FISSEQ相比更是如此。但需要注意的是，该方法仅在培养细胞上进行了展示。

STARmap
STARmap使用条形码挂锁探针，与靶标杂交，但通过添加第二个引物，针对挂锁探针旁边的位点，避免了逆转录（RT）步骤。这种方法避免了cDNA转换的效率障碍，并通过增加第二个杂交步骤来降低噪音。在介绍该方法的文章中，最吸引的特点是能够对完整的组织样本进行3D分析，保留了细胞的方向性，而不仅仅是单一的2D层。但需要注意的是，这种能力只表现在100~150微米厚的切片和较少的目标数量上。

FISSEQ
到目前为止，所提到的方法都是基于对靶标的先验知识，FISSEQ是一种非靶标的方法，即捕获所有种类的RNA。2019年，FISSEQ的研究小组又提出了原位转录组可及性测序（INSTA-Seq）。通过这种方式，规避了典型ISS方法对短读信息的限制。

原位捕获技术

迄今为止所描述的空间技术是基于以下两种情况：分离已知的感兴趣的组织区域，或通过杂交或测序对RNA分子进行原位可视化。另一种方法是在原位捕获转录物，然后进行异位测序。


                                                       原位捕获技术概述

空间转录组（ST）
2016年发表的空间转录组学（ST）技术可以得到空间分辨的全转录组信息。2018年底，ST技术被10X Genomics公司收购并进一步开发，命名为 "10X Visium"。"10X Visium检测法在分辨率（直径55µm，条形码区域之间的距离更小）以及运行时间上都有改进。

Slide-Seq
代替在玻片上打印区域条形码RT引物，人们可以将它们附着在溶液中的珠子上，然后将它们分配到玻璃表面。这一方法是由Slide-seq技术的研究团队在2019年采用的。与其他原位方法相比，组织图像是从相邻切片获得的，而不是从相同的切片获得RNA数据。

HDST
在Slide-seq方法发表后不久，另一种使用更小的条形码珠子的技术发布，命名为高分辨率空间转录组技术（HDST）。

Nanostring GeoMx Digital Spatial Profifiler
Nanostring GeoMx Digital Spatial Profifiler的差异化在于它能够应用于FFPE样品。该仪器还具有空间剖析蛋白质的能力，尽管不是在同一组织切片上。它以迭代的方式工作，用户通过不同大小的显微镜（直径10-600 µm）手动选择感兴趣的区域（ROI）。

APEX-Seq
APEX-Seq可以对单个活细胞内的内源性RNAs的亚细胞定位进行分析。由于APEX-Seq需要重组技术，因此该方法不适用于正常组织。

空间数据的计算机重建

除了前面介绍的实验方法外，还有构建空间解析基因表达数据集的计算方法。这些技术从解离的单细胞开始，旨在根据基因表达谱，通过计算将其分配到一个空间位置。细胞到空间位置的映射可以基于参考图（其中使用一组信息性的基因签名来指导细胞的适当放置）来实现，或者可以基于关于跨越物理空间的表达特征的假设来重新寻找。

总结

做空间转录组研究容易忽略的注意事项：

• FOV，即可以在单个实验中分析的组织大小，将在很大程度上决定该研究的可行性。
  
• 软件可用性，目前还有很多技术没有分析软件。尽管商业供应商正在开发自己的软件，而且学术界也在努力创建统一的分析流程，但该领域的研究人员目前还是创建内部软件来解决特定问题。
  
• cDNA逆转录。包括RT步骤的方法可能会受到酶学偏差的影响。
  
• 样本类型，尽管现在通常使用FFPE样本，但是大多数空间转录组学方法的样本只能是新鲜的冷冻组织。
  
• 当前技术的固有局限在于，他们只提供动态图谱。因此，对时空转录组学的研究是通过使用不同时间点的多个样本或使用非空间单细胞研究来进行的。
  

目前，空间转录组技术大多数情况下还只是应用于基础研究。但是，这些技术可能会成为个性化医学的重要工具，在一些组织中，局部作用的免疫反应和克隆可能对于治疗诊断十分重要。而这些技术应用于临床还需要解决工作流程复杂，费用较高等问题。

技术发展的一个驱动力是一些正在进行的大型合作研究，以创建全面和公开可用的数据集。同时，需要建立新的分析工具和标准化程序，以便能够将所有这些不同的技术结合起来，每种技术都有其独特的特点、数据格式、优势和注意事项。空间转录组学领域正在加速技术进步，而这一进展使许多生物学分析成为可能。

参考文献

Asp M, Bergenstråhle J, Lundeberg J. Spatially Resolved Transcriptomes—Next Generation Tools for Tissue Exploration[J]. BioEssays, 2020: 1900221.
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