做ELISA实验的注意事项有哪些？

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做ELISA实验的注意事项有哪些？
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队长是我

　　在ELISA实验过程，我们实验过程经常会出现一些误差，例如操作误差、样本试剂误差、仪器误差等。为了实验更顺利进行，我们需要了解酶联免疫吸附实验常见的误差。今天，通蔚生物为大家详细介绍下在ELISA实验中常见的误差。



ELISA实验

1、留意试剂盒保质期。买回来的试剂盒除了正确的保存之外，要留意试剂盒的保质期，过期的试剂盒请误用于实验。
2、咨询阅读说明书。在进行ELISA实验前，请详细阅读说明书，严格按照说明书规范进行规范化操作。对于不同批号的试剂盒不可混用，对于值得改进的地方要反复实验确定成立后才能改进。
3、评估试剂实用及稳定性。试剂的稳定性和实用性保证实验结果的准确性、可靠性和可重复性至关重要！在试剂启用之前，务必进行阴、阳对照及样品反复比照试验，如试剂符合要求，方可使用。
4、使用校对过的微量移液器，排除自然误差。移液器应该定期校准，频率取决于使用频率、环境条件和实验室的质量要求。一般建议至少一年校准一次，如果使用频繁或对精度要求较高，则需要更频繁地校准，例如每三个月或半年一次。如果移液器曾经跌落、损坏或暴露在极端环境下，则需要重新校准。
5、加样准确，快速。加样或多或少，对酶生成物的量不能确定，直接会影响显色的结果。显色的深浅及A值的测定与加入显色剂和终止液的量有关！因此，加样要慎重！这里要求大家在加样尽量做到在一定时间内加样完毕的实验，如果加样迟缓，便出现误差，而且试剂长时间暴露在外，尤其室温过高时，保存期会缩短甚至失效。
6、洗涤液要新鲜，洗涤要彻底。不新鲜的洗涤液会出现本底增高现象，也可能出现假阳性。这里要求大家在使用洗涤液现用现配的原则；在洗涤过程要彻底，否则酶结合物本底显色会呈现假阳性。
7、严格的控制反应时间。 反应时间过长，酶容易失活；反应时间过段，酶结合物不能与血清中的微生物抗原抗体充分结合，生成物结构松散不牢固，容易洗掉，都可能造成假阴性。
8、严格的掌握显色时间。认真阅读试剂盒说明书，每个ELISA试剂盒都有其推荐的显色时间范围，通常在5-30分钟之间。显色时间过短，加入终止液反应终止后，底物结合物的量过少，易出现假阴性；如果超过显色时间，如操作误差（如孵育温度过高）、试剂污染等也可能导致非特异性显色，这些情况也可能造成颜色过深。
　　上述为大家介绍ELISA实验过程如何避免误差，细节决定成败！从细微的实验中观察，实验和总结，避免因误差导致实验反复！也希望上述内容对您的实验有所帮助，如果您还有更好的减小实验误差妙招请多交流！

卡卡

ELISA也是一个非常成熟的技术了，也是很好用的一个方法，但在国内的使用方面似乎一直不如预期的好。个人也有一些年没有使用这个了。
也有几个关于ELISA的回答了。
就顺便提个问题，欢迎答疑与沟通宣讲。
在解决或克服抗原包被问题方面，各厂商的产品主要有什么技术特点？
另一个问题是显色系统，稳定性和保质期情况如何？

同花顺

ELISA实验原理简单，步骤少，流程短，试剂盒操作相对简便，实验小白也能轻松上手。然而，实验上手虽快，想要得到可靠的实验结果，却并不那么容易。



为了更好地助力实验，这里将大家关心的ELISA试剂盒＆样本常见问题整理如下：
试剂盒
Q1   你们的ELISA试剂盒能检测什么物种？
A1
目前我们的试剂盒检测的种属主要为人、小鼠、大鼠；小部分指标涉及猴、兔、猪、鸡等特殊种属。
如果试剂盒的命名带有特定指向（如人），代表专门针对此物种；没有指明物种，则代表该试剂盒在目前公司产品涉及的种属（例如人、小鼠、大鼠、猴、兔等）内通用；其他特殊种属的检测适用性，请联系技术支持确认。
Q2   96T ELISA试剂盒能检测多少样本？是否需要做复孔？
A2
为了保证实验结果的准确性，我们建议标准品和样品都做复孔，但并不强行要求ELISA实验一定要做复孔/3复孔，客户可根据自己的需求设定复孔实验。详细信息见下表：


Q3   需检测的样品较多，能否减少标曲的孔数？
A3
为保证结果的准确度，不建议减少标曲的孔数，请确保能够检测至少6个不同的标准品浓度（含空白孔)。

Q4   ELISA试剂盒要使用多次，但样本较多，是否可以只做一次标曲？
A4
虽然ELISA实验的操作步骤相同，但每次实验的各种影响因素都会有所变化。所以，每次实验时，都必须重新绘制标准曲线，以得到更准确可靠的检测结果。
如果需要做多次实验，溶解后的最高浓度标准品可以分装保存于-20℃条件下，避免反复冻融，半个月内使用有效。



样本
Q1   血清血浆样本应该选用哪种真空采血管收集？
A1
血清：不含抗凝剂的采血管/含促凝剂采血管
（通常为红色、黄色、橘色管盖的采血管）
血浆：含抗凝剂的采血管
（通常为绿色、紫色管盖的采血管）
样品收集后，若在1周内进行检测，可保存于2-8℃条件下；若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃条件下（1个月内检测）或-80℃条件下（3个月内检测），避免反复冻融。
检测前，应缓慢融化冷冻过的样本，并离心除去冻融过程中产生的沉淀物。
Q2   采集时，如何尽可能避免溶血现象？
A2
溶血可由多种理化因素和毒素引起。在体外，机械性强力振荡、低温冷冻等诱因均可引起溶血。为避免溶血对检测结果产生影响，应注意：
（1）静脉采血时，回抽压力不宜过大；
（2）一次性采血量不宜过少；
（3）采集的全血不宜激烈振荡；
（4）离心转速不宜过大；
（5）收集的全血需尽快处理成血清/血浆，全血不能冻融；
（6）若需要麻醉采血，需使用没有溶血作用的麻醉剂。
Q3   组织/细胞样本收集中提到的“反复冻融”，过程应该如何操作？
A3
组织样本：组织研磨后，将其-80℃放置1h/液氮放置0.5h，再置于30℃水浴锅中轻微振荡，使其迅速融化，反复操作1-2次即可；
细胞样本：按上述操作步骤，反复冻融2-3次。若为膜蛋白，可以适当做超声处理，但需要控制好超声的温度、频率；
建议在样本中提前加入蛋白酶抑制剂。常规情况下推荐使用PMSF。
Q4   怎样判断我的样本是否需要稀释或做其他处理？
A4
试剂盒的检测范围不等同于样本中待测物的浓度范围，建议实验前通过相关文献预估样本中待测物的浓度，并通过预实验确定样本的实际浓度情况。
如果是常规样本类型，可以咨询ELISA技术支持，以获取样本的推荐稀释倍数，并安排预实验检测；
如果样品中待测物的浓度过高或过低，请对样本做适当的稀释或浓缩；
如果样本中的分析物浓度远低于试剂盒的最低检测限，建议选择灵敏度更高的试剂盒来检测。

检验医师

这个视频介绍了间接法ELSIA的实验操作流程；
不同种类ELisa（直接法、间接法、竞争法、夹心法）的区别；
还有Elisa实验常见问题解析。
英国biorbyt：手把手教你ELISA实验操作和常见问题解析

继续前进

酶联免疫吸附试验 (ELISA)是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。ELISA实验操作简单，但其影响因素却很多,其中一个因素的改变可能会影响到其它条件的改变,最终影响整个结果的准确性。
注意事项：
01 标本
对于血清标本，采集血液时需注意溶血。此外，为避免细胞裂解释放出目标检测分子影响实验，检测物宜进行离心去除细胞成份。
02 加样
确保将所加物加至板孔底部，避免加在孔壁上部，不可溅出或产生气泡。加不同物质时应注意更换枪头，避免发生交叉污染。显色时，最好使用排枪迅速完成加液过程，以减少反应时间不一致引起的孔间差异。
03 稀释
在稀释过程中,要注意使用同一微量加样器、同一类枪头和容器,保证所稀释液体容量一致。
04 孵育
37℃恒温箱孵育时，酶标板应放在湿盒内,湿盒应选用传热性良好的材料如金属等,在盒底垫湿纱布,并将酶标板放在湿纱布上，酶标板不可叠放,以保证各板的温度能迅速平衡。孵育时间一般为1～1.5h，不宜过长。如采用4℃孵育,则应将酶标板包好,以免试剂与外界反应或蒸发。
05 洗涤
应严格按要求洗涤,保证洗涤液注满各孔,洗完板后最好在吸水纸(干净、无或少尘的吸水材料)上轻轻拍干,并应严格遵守洗涤时间。
06 显色
显色液应现用现配；加样的工作环境不能处于阳光直射的环境下，加完显色液后要避光反应，显色液量不能过多，以免显色过强。
07 读板
比色前应先用洁净的吸水纸擦干酶标板底附着的液体,以减少干扰。酶标仪应安置在避光环境下，操作室温宜在15～30℃，在使用前应先预热酶标仪15-30分钟，使测定结果更加稳定。