我做的pcr跑完胶完全没条带怎么回事？就好像没加DNA似的。？

balabala

我做的pcr跑完胶完全没条带怎么回事？就好像没加DNA似的。？
原文地址：https://www.zhihu.com/question/52347532

继续前进

这么明显的引物二聚体，说明酶 dNTP buffer等都加了，这些一般没什么问题，排除。
做pcr加的也就这么几个东西，很明显是引物不特异或者模板不对。
解决方法
1.换模板重p。模板要么加错了，浓度太高或者太低了，要么降解了
2.针对你的模板重新设计引物，最好设计简并引物

清风寡欲

除marker之外亮的部分是引物二聚体。
作为昔日的pcr砖工，按我的经验来看，这种豪无smear的条带应该是啥都没p出来。
下面你需要检查几个部分：
1. 酶和buffer是否过期or配套（听起来很荒谬，但这是很多人都会犯的错误）
2. 检查引物与模版是否正确……（嗯、根本问题不能错，尤其是右端引物在设计时有没有反向互补，推荐傻瓜软件snapgene）
3. 检查模板量是否过量，模板过多会导致无法p出来，建议将模板进行10的梯度稀释，做梯度pcr
3. 检查引物的结构，ncbi中有相关的工具，虽然我的经验是不论结构多差只要和模板有10bp以上的重复序列都能p出来。
4. 上述都确定完没问题依然p不出来请降低退火温度，尝试进行温度梯度pcr。
5. 加少量镁离子
6. 最后不行的话……把taq换成primestar吧……高保真酶，贵，好用。taq酶p不出来的很多奇怪的序列primestar一上就灵……
最后，你加反应体系的时候搅匀离心了么……暴力实验的时候我会拿枪头进去搅搅…防止酶和dntp分布不均……
这个问题为什么会出现在我的时间线上呢？我为什么会来回答呢？我明明已经……

清风寡欲

你要看看
你pcr之前
是不是
没 离 心
哈哈哈哈哈哈哈哈哈哈哈哈哈哈哈哈哈哈哈哈哈哈（苦笑）
抖机灵（其实也不算）完毕
1.看看模板引物加没加错，酶以及体系其他成分加没加错
2.都没问题的话尝试降低退火温度。实在p不出来降到55℃到50℃都可以试试

清风寡欲

引物问题，我遇到过类似情况
前面部分都是用的新订引物，最后面七个重复试验仍旧用的旧引物  与前面七个DNA模板一样，其他条件也一样。 结果差异很大

感恩由您

从最底部的引物条带看确实是加了引物的，但是要么反应挂了，要么产物就是上面没跑下来的那个超大片段。
首先普及一下实验常规，PCR图谱应该标好上样样品名、marker大小、目标条带大小、日期，操作者名字。其次如果没有你要的产物，检查模板、引物和酶有没有用对，最后调整条件重试
(这还是前不久的一道面试题.....)