酶动力学

风云

一、名词解释

• 酶促反应动力学（Enzymatic reaction kinetics）
  指研究酶促反应速率及影响此速率的各种因素（如温度、pH、底物浓度等）的科学。在研究酶结构与功能的关系及酶作用机制时，需动力学提供实验证据。为发挥酶催化反应的高效率寻找最有利反应条件；为了解酶在代谢中的作用和某些药物的作用机制等均需掌握酶促反应速率规律。
  
• 米氏常数（Michaelis constant）（Km）
  Km称为米氏常数，是由一些速率常数组成的一个复合常数，为米氏酶的特征常数。对于一个给定反应，导致酶促反应速度的起始速度（v0）达到最大反应速度（vmax）一半时的底物浓度，单位是mol·L-1。对于遵守米氏动力学的反应，Km是酶发生有效催化时，对所需底物浓度的一种尺度，即具有高Km的酶比具有低Km的酶需要更高的底物浓度才能到达给定的反应速率，即Km越大，亲和力越小。
  
• 米氏方程（Michaelis-Menten equation）
  表示一个酶促反应的起始速度（v）与底物浓度（[S]）关系的速度方程，v＝Vmax[S]/（Km+[S]）。在酶促反应中，在低浓度底物情况下，反应相对于底物是一级反应；而当底物浓度处于中间范围时，反应（相对于底物）是混合级反应。当底物浓度增加时，反应由一级反应向零级反应过渡。
  
• Kcat
  Kcat也称为酶的转换数（turnover number，TN），是酶的最大催化活力的量度。TN定义为：当酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子或每个活性部位（对多亚基酶而言）将底物转换为产物的分子数，转换数也称为分子活力。Kcat值越大，表示酶的催化效率越高。
  
• 可逆抑制（reversible inhibition）
  抑制剂与酶以非共价键结合而引起酶活力降低或丧失，能用物理方法除去抑制剂而使酶复活，这种抑制作用是可逆的，称为可逆抑制。根据可逆抑制剂与底物的关系，可逆抑制作用分为4个类型：竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制、混合型抑制。
  
• 竞争性抑制作用（competitive inhibition）
  是最常见的一种可逆抑制作用，大多数竞争性抑制剂（I）与底物（S）结构类似，因此能与酶的活性部位结合，与酶形成可逆的EI复合物，但EI不能分解成产物P，酶反应速率下降。其抑制程度取决于底物及抑制剂的相对浓度，这种抑制作用可以通过增加底物浓度而解除。例如，磺胺是对氨基苯甲酸的类似物，丙二酸和戊二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制。这种抑制使得Km增大，而Vmax不变。
  
• 非竞争性抑制作用（noncompetitive inhibition）
  底物和抑制剂同时和酶结合，两者没有竞争作用。酶与抑制剂结合后，还可以与底物结合，但是中间的三元复合物不能进一步分解为产物，因此酶活力降低。这类抑制剂与酶活性部位以外的基团相结合，其结构与底物无共同之处，这种抑制作用不能用增加底物浓度而解除。例如，亮氨酸是精氨酸酶的一种非竞争性抑制剂，某些重金属离子也是酶的非竞争性抑制剂。这种抑制使得Vmax变小，但Km不变。
  
• 反竞争性抑制作用（uncompetitive inhibition）
  酶只有与底物结合后，才能与抑制剂结合，中间的三元复合物不能进一步分解为产物，因此酶活力降低。例如，肼类化合物抑制胃蛋白酶，氰化物抑制芳香硫酸酯酶。这种抑制作用使得Vmax，Km都变小，但Vmax/Km比值不变。
  
• Ks型不可逆抑制剂（Ks-type irreversible inhibitors）
  这类抑制剂是根据底物的化学结构设计的，具有底物类似的结构，可以和相应的酶结合，同时还带有一个活泼的化学基团，能与酶分子中的必需基团反应进行化学修饰，从而抑制酶活性。因抑制是通过对酶的亲和力来对酶进行修饰标记的，故称为亲和标记试剂。这种抑制剂专一性有一定的限度，抑制剂与酶的亲和力决定了它的抑制作用强弱和选择性高低，故这类抑制剂也称为Ks型不可逆抑制剂。
  
• kcat型不可逆抑制剂（Kcat-type irreversible inhibitors）
  kcat型抑制剂不但具有天然底物的类似结构，且本身也是酶的底物，能与酶结合发生类似于底物的变化。但抑制剂有一个潜伏的反应基团，当酶对它进行催化反应时，这个潜伏反应基团被暴露或活化，并作用于酶活性部位的必需基团或酶的辅基，使酶不可逆失活。这类抑制剂是专一性极高的不可逆抑制剂。因此kcat型抑制剂也称为自杀性底物。
  

二、问答题

• 什么是米氏常数Km？什么是米氏方程？用什么方法可以测得米氏常数？
  答：（1）Km称为米氏常数，是由一些速率常数组成的一个复合常数，为米氏酶的特征常数。对于一个给定反应，导致酶促反应速度的起始速度（v0）达到最大反应速度（vmax）一半时的底物浓度，单位是mol·L-1。对于遵守米氏动力学的反应，Km是酶发生有效催化时，对所需底物浓度的一种尺度，即具有高Km的酶比具有低Km的酶需要更高的底物浓度才能到达给定的反应速率，即Km越大，亲和力越小。
  （2）米氏方程为表示一个酶促反应的起始速度（v）与底物浓度（[S]）关系的速度方程，v＝Vmax[S]/（Km+[S]）。在酶促反应中，在低浓度底物情况下，反应相对于底物是一级反应；而当底物浓度处于中间范围时，反应（相对于底物）是混合级反应。当底物浓度增加时，反应由一级反应向零级反应过渡。
  （3）常用作图法来测米氏常数，有以下几种作图法
  ①Lineweaver-Burk双倒数作图法：将米氏方程式两侧取双倒数，即一个酶促反应速度的倒数（1/v）对底物浓度的倒数（1/）的作图。横轴截距为-1/Km；纵轴截距为1/vmax。该作图的缺点是：实验点过分集中在直线的左下方，而低浓度的S的实验点又因倒数后误差较大，往往偏离直线较远，从而影响Km和vmax的准确测定；优点是：使用方便，Km和vmax都较容易求。
  ②Eadie-Hofstee作图法：其纵轴截距为Vmax，斜率为-Km；优点是求Km比较方便，缺点是作图前计算较繁。
  ③Hanes-Woolf作图法：其横轴截距为-Km，斜率为1/Vmax；优点是求Km比较方便，缺点是作图前计算较繁。
  ④Eisenthal和Cornish-Bowden 直接线性作图法：直线交于一点，这一点坐标为Km和Vmax；优点是不需计算，作图方便，结果准确；另外它使人们容易识别出那些不正确的观测结果，这些结果将产生不通过靠近共同交叉点直线。
  
• 酶的抑制剂有哪些？说明其特点
  答：（1）不可逆抑制剂：按照不可逆抑制作用的选择性不同，可将其分为非专一性不可逆抑制剂和专一性不可逆抑制剂。
  1）非专一性不可逆抑制剂：作用于酶的一类或几类基团，这些基团中包含了必需基团，作用引起酶的失活，主要有以下几类：
  ①有机磷化合物：能抑制某些蛋白酶及酯酶活力，与酶分子活性部位的丝氨酸羟基共价结合，从而使酶失活。这类化合物强烈地抑制与神经传导有关的胆碱酯酶活力，使乙酰胆碱不能分解为乙酸和胆碱，引起乙酰胆碱的积累，使一些以乙酰胆碱为传导介质的神经系统处于过度兴奋状态，引起神经中毒症状和呼吸障碍，因此这类有机磷化合物又称为神经毒剂。解磷定或氯磷定能把酶上的磷酸根除去，使酶复活，在临床上它们作为有机磷中毒后的解毒药物。
  ②有机汞、有机砷化合物：这类化合物与酶分子中半胱氨酸残基的巯基作用，抑制含巯基的酶。这类抑制可通过加入过量的巯基化合物如半胱氨酸或还原型谷胱甘肽（GSH）而解除。
  ③重金属盐：含Ag+、Cu2+ 、Hg2+、Pb2+、Fe3+的重金属盐在高浓度时，能使酶蛋白变性失活。在低浓度时对某些酶的活性产生抑制作用，一般可以使用金属螯合剂如EDTA、半胱氨酸等螯合除去有害的重金属离子，恢复酶的活力。
  ④烷化试剂：这一类试剂往往含一个活泼的卤素原子，被作用的酶分子侧链基团有巯基、氨基、羧基、咪唑基和硫醚基等。
  ⑤氰化物、硫化物和CO：这类物质能与酶中金属离子形成较为稳定的络合物，使酶的活性受到抑制。如氰化物与细胞色素氧化酶中的Fe2+络合，使酶失活，阻止呼吸。
  2）专一性不可逆抑制剂：专一性的不可逆抑制剂可分为Ks型和Kcat型2两大类
  ①Ks型不可逆抑制剂：这类抑制剂是根据底物的化学结构设计的，具有底物类似的结构，可以和相应的酶结合，同时还带有一个活泼的化学基团，能与酶分子中的必需基团反应进行化学修饰，从而抑制酶活性。因抑制是通过对酶的亲和力来对酶进行修饰标记的，故称为亲和标记试剂。这种抑制剂专一性有一定的限度，抑制剂与酶的亲和力决定了它的抑制作用强弱和选择性高低，故这类抑制剂也称为Ks型不可逆抑制剂。例如：TLCK是胰蛋白酶的Ks型不可逆抑制剂，3-溴丙酮醇磷酸是磷酸丙糖异构酶的亲和标记试剂。
  ②Kcat型不可逆抑制剂：kcat型抑制剂不但具有天然底物的类似结构，且本身也是酶的底物，能与酶结合发生类似于底物的变化。但抑制剂有一个潜伏的反应基团，当酶对它进行催化反应时，这个潜伏反应基团被暴露或活化，并作用于酶活性部位的必需基团或酶的辅基，使酶不可逆失活。这类抑制剂是专一性极高的不可逆抑制剂。因此kcat型抑制剂也称为自杀性底物。例如：青霉素是糖肽转肽酶的Kcat型不可逆抑制剂。
  （2）可逆抑制剂
  抑制剂与酶以非共价键结合而引起酶活力降低或丧失，能用物理方法除去抑制剂而使酶复活，这种抑制作用是可逆的，称为可逆抑制。根据可逆抑制剂与底物的关系，可逆抑制作用分为4个类型：竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制、混合型抑制。
  ①竞争性抑制：是最常见的一种可逆抑制作用，大多数竞争性抑制剂（I）和底物（S）结构类似，因此能与酶的活性部位结合，与酶形成可逆的EI复合物，但EI不能分解成产物P，酶反应速率下降。其抑制程度取决于底物及抑制剂的相对浓度，这种抑制作用可以通过增加底物浓度而解除。例如，磺胺是对氨基苯甲酸的类似物，丙二酸和戊二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制。这种抑制使得Km增大，而Vmax不变。
  ②非竞争性抑制：底物和抑制剂同时和酶结合，两者没有竞争作用。酶与抑制剂结合后，还可以与底物结合，但是中间的三元复合物不能进一步分解为产物，因此酶活力降低。这类抑制剂与酶活性部位以外的基团相结合，其结构与底物无共同之处，这种抑制作用不能用增加底物浓度而解除。例如，亮氨酸是精氨酸酶的一种非竞争性抑制剂，某些重金属离子也是酶的非竞争性抑制剂。这种抑制使得Vmax变小，但Km不变。
  ③反竞争性抑制：酶只有与底物结合后，才能与抑制剂结合，中间的三元复合物不能进一步分解为产物，因此酶活力降低。例如，肼类化合物抑制胃蛋白酶，氰化物抑制芳香硫酸酯酶。这种抑制作用使得Vmax，Km都变小，但Vmax/Km比值不变。
  ④混合型抑制：混合型抑制剂与酶结合后会部分影响酶与底物的结合，其结果介于竞争性抑制和非竞争性抑制之间。混合型抑制多见于双底物和多底物酶促反应。例如：邻甲苯甲醛和间甲苯甲醛对酪氨酸酶的抑制。
  
• 简述Ks型和Kcat型抑制剂不同以及特点。
  （1）不同点：
  1）作用机制不同；
  ①Ks型不可逆抑制剂是根据底物的化学结构设计的，具有底物类似的结构，可以和相应的酶结合，同时还带有一个活泼的化学基团，能与酶分子中的必需基团反应进行化学修饰，从而抑制酶活性。这种抑制作用是通过形成非共价络合物来实现的，其专一性取决于抑制剂与活性部位必需基团的解离常数以及与非活性部位同类基团的解离常数之比（即Ks比值）。
  ②kcat型不可逆抑制剂在被酶催化后才能形成真正的抑制剂。它具有天然底物的类似结构，且本身也是酶的底物，当酶对其进行催化时，潜伏的反应基团被暴露或活化，并作用于酶活性部位的必需基团或酶的辅基，使酶不可逆失活。这类抑制剂具有很高的专一性。
  2）结构特点不同：
  ①Ks型不可逆抑制剂结构类似于底物，但还包含一个能够与酶活性位点反应的活泼基团。
  ②kcat型不可逆抑制剂不仅结构上模仿了天然底物，而且含有一个在初始状态下不活跃、但在酶的作用下变得活跃的“潜伏”反应基团。
  3）与酶的结合方式不同：
  ①Ks型不可逆抑制剂通过模拟底物与酶的非活性区域相结合，进而影响到酶的活性中心。
  ②kcat型不可逆抑制剂则直接与酶的活性中心相互作用，并在那里经历一个转化过程，最终导致酶的失活。
  （2）特点
  1）Ks型不可逆抑制剂
  ①酶活性部位必需基团与I的化学计量关系是1:1；
  ②真正底物S可竞争性阻断其抑制作用。
  2）kcat型不可逆抑制剂
  ①自杀底物Si浓度越大，抑制作用越大，其抑制动力学呈一级反应；
  ②在Si过量时，加入酶越多，产生的抑制越大；
  ③Si本身无抑制作用而生成的I是一种亲和标记抑制物；
  ④酶活性部位必需基团与I的化学计量关系是1:1；
  ⑤真正底物S可竞争性阻断Si的抑制作用。
  
• 影响酶促反应速率的因素有哪些？
  答：①底物浓度的影响：
  催化某一化学反应时，酶首先和底物结合生成中间复合物（ES），然后生成产物（ P），并释放出酶。当底物浓度较低时，反应速率与底物浓度的关系呈正比，表现为一级反应。随着底物浓度的增加，反应速率不再按正比升高，反应表现为混合级反应。当浓度达到相当高的时候，底物浓度对反应速率影响变小，最后反应速率与底物浓度几乎无关，反应达到最大速度（Vmax），表现为零级反应。   
  ②酶浓度的影响：
  如果底物浓度足够大，使酶饱和，则反应速度与酶浓度成正比。
  ③pH的影响:
  a.引起酶的空间构象发生改变。
  b.酶反应介质的pH可影响酶分子，特别是酶活性中心上必需基团的解离状况和解离程度，以及催化基团中质子供体或质子受体所需的离子化状态，同时也可影响底物和辅酶（或辅基）的解离状态和解离程度，从而影响到酶与底物的结合。
  c.引起酶的活性部位的构象改变。
  ④温度对酶促反应速度的影响：
  从低温开始反应速率随温度升高而增加，达到一定温度后，反应速率最大，此温度为酶的最适温度，最适温度不是酶的特征常数，温度达到一定高度后，作为酶的蛋白质开始热变性，逐渐失去活性，反应速率反而随温度升高而下降，形成倒V形曲线。
  ⑤激活剂的影响：凡是能提高酶活性的物质都称为激活剂，其中大部分是无机离子（如：K+、Na+、Ca2+、Cl-、I-、等离子）或简单的有机化合物（如：半胱氨酸、还原性谷胱甘肽等），另外还有对酶原起激活作用的蛋白酶。激活剂对酶的作用具有一定的选择性，即一种激活剂对某种酶起激活作用，而对另一种酶可能起抑制作用。
  激活剂的作用特点：
  a.酶对激活剂具有一定的选择性；
  b.某些离子具有拮抗作用；
  c.有些金属离子激活剂可以相互替代；
  d.激活剂的作用常和它的浓度有关。
  ⑥除上述因素外，还有抑制剂和产物浓度等影响酶促反应速率。
  抑制剂：能使酶活性下降而不引起酶蛋白变性的物质称为抑制剂。抑制剂通过占据酶的活性部位或通过其他方式影响酶的构象，从而降低酶的活性，进而减缓反应速度。抑制剂的作用机制可以分为竞争性抑制剂和非竞争性抑制剂。
  抑制作用：由于酶的必需基团化学性质的改变，但是酶未变性，而引起酶活力的降低或者丧失。
  

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