Western blot最全操作详解+常见问题分析

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Western blot最全操作详解+常见问题分析



WB作为分子生物学中最常用的实验，包含了很多技巧与知识，想做出漂亮的WB检测结果不是一件易事。

本文针对WB实验各步骤展开了详细解读，包含实验原理及流程、具体操作、注意事项。内容较长，可结合小标题查看。

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WB实验简介



WB实验原理WB experimental principle免疫印迹（Immunoblotting）又称为蛋白质印迹（Western Blot，WB），是一种综合性的免疫学检测技术，用于检测细胞或组织提取物中的蛋白表达水平。

这项技术利用待检测蛋白与抗体的特异性结合，测定生物样本中的蛋白水平，已经被广泛应用并得到公认。

目前，WB技术已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。WB实验一般分为SDS-PAGE样本制备、凝胶电泳、转膜、封闭、抗体孵育及免疫检测等步骤。


WB实验原理示意图

WB实验常见流程WB标准流程：样本制备→凝胶上样、电泳→转膜→封闭→抗体孵育→显影


WB标准流程图
WB实验前准备阶段
实验前需要了解重要信息实验开始前一定要做的事情，是对所研究的目的蛋白在待测样本中的表达水平、蛋白大小、翻译后修饰等背景信息进行深入的了解，同时也需要设置严格的阴性、阳性对照样本。这将有助于在实验出现异常结果时进行排查分析。

通常我们会参考文献或数据库进行样本的选择，下面列举几个常见数据库：

该蛋白在什么组织中表达？
1）网址：http://www.biogps.org
通过mRNA表达水平给您参考估计不同样本中目的蛋白的表达水平；样本种属可以选择人、小鼠、大鼠等。还可以链接其他的数据库。

2）网址：http://www.proteinatlas.org
简称HPA数据库，提供人类蛋白质在组织和细胞的分布，并用免疫组化技术。

该蛋白有没有其他的修饰形式？
1）网址：http://www.uniprot.org
了解目的蛋白的基因名、别名、功能、可变剪切体、蛋白表达位置、可修饰类型等。

2）网址：http://www.phosphositeplus.org
是蛋白质翻译后修饰权威数据库，查阅修饰类蛋白的表达条件和丰度、刺激方式等。

WB实验流程重点分享
01第一步：样本制备
样本制备4个步骤样本制备分为样本获取、蛋白裂解、蛋白定量、蛋白定性等4个关键步骤。

①样本获取：组织或细胞取材；
②蛋白裂解：从组织或者细胞中释放获取蛋；
③蛋白定量：获悉蛋白浓度，为后续电泳步骤提供上样量依据；
④蛋白变性：使蛋白变性形成线性结构，方便跑胶和抗体结合。
样本制备之裂解液的选择


▲组织和细胞破碎过程中常用的裂解液为RIPA裂解液，其中根据蛋白性质的不同，我们选择的裂解液也不同。

02第二步：凝胶上样、电泳
操作须知①凝胶制备：
聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。

它有两种形式：SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）及非变性聚丙烯酰胺凝胶（Native-PAGE）。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺聚合而成，形成一个三维网状的结构，它具有分子筛效应。


②上样与电泳：
a）蛋白预染Marker：采用预染色标记可以看见电泳过程中蛋白迁移的距离，为了便于观察电泳效果与转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，在电泳时通常要使用预染的蛋白分子量标准。根据待测蛋白的分子量大小，挑选合适的Marker。

b）加入足量的样品：SDS-PAGE根据蛋白电泳迁移率将其分离，迁移率是蛋白大小和电荷的函数。我们建议在预制Tris-Glycine小孔胶上样20-30μg总蛋白或100ng纯蛋白；对于组织，我们通常建议上样量最多100μg总蛋白，具体取决于靶标表达水平；但是，如果蛋白水平低于检测值，在电泳之前可能还需要进行免疫沉淀以富集待测蛋白。

c）尽量保持每个泳道的蛋白量一样，体积尽量一致，方便后续观察蛋白的表达量。

d）空置的泳道用等体积的1x Loading Buffer补齐，防止最后的一两个样品条带上扬。



03第三步：转膜1.转膜原理蛋白质经SDS-PAGE分离后，必须及时从凝胶中转移到固相支持物上，固相支持物能牢固结合蛋白又不影响其抗原活性，这使其比直接在凝胶上检测更易操作。蛋白质从凝胶向膜转移的过程常采用电转印法包括湿转和半干转，与SDS结合的蛋白带有负电，在电场中向正极迁移，并最终结合在固相支持物上。2.膜的选择


▲现阶段常用的转印膜主要是PVDF膜、NC膜这2种，PVDF膜可以提供更好的蛋白截留率、物理强度和广泛的化学兼容性。
3.转膜方法




▲转膜的方法分为：湿转、半干转、干转，其中湿转是转膜最完全、应用最广的方法。
4.转膜必看注意事项①大分子量蛋白：转膜缓冲液里加入0.1%的SD5；甲醇浓度降到10%甚至更少，用4℃湿转过夜代替半干法转膜；增加转膜时间、电流/电压；

②小分子量蛋白：去净缓冲液里的SDS；保持甲醇浓度在20%；用小孔径的膜；降低转膜时间、电流/电压；

③膜的方向确定: 转移后剪角做标记，分清正反面；用铅笔做记号或电泳时Marker上成非对称的；

④转膜后背景高: 选择NC膜；

⑤转膜时污染: 避免手指触碰膜，可以用镊子来取膜，油脂和蛋白质会弄脏膜；

⑥滤纸的大小：确保滤纸和膜的大小与胶一致，当使用半干法转膜时，过多的部分会阻碍电流穿过膜。
04样第四步：膜封闭本制备
1.封闭的目的


▲转印结束后，必须将对印迹膜上未被占据的蛋白结合位点封闭掉以防止非特异性探针结合。如果没能将膜上位点全部封闭将会导致印迹膜出现比较高的背景，因为很多检测探针也是蛋白，也会与膜结合。
2.封闭液的选择通常有两种常用的封闭剂，牛血清白蛋白（BSA）和脱脂奶粉。

一般来说，脱脂奶粉的封闭效果更强，但有时 BSA 比脱脂奶粉更有利于降低非特异性背景，而有些抗体则在脱脂奶粉封闭的情况下才能得到清晰的背景。

脱脂奶粉：性价比较高；通常使用浓度为2.5%~5%；不能用于磷酸化蛋白，因为脱脂奶粉中的酪蛋白本身是一种磷酸化蛋白，会结合磷酸化特异性抗体而易产生高背景。

牛血清蛋白（BSA）：通常使用浓度为2%~5%；某些抗体用BSA封闭会产生比脱脂牛奶更强的信号，确定抗体使用的特殊需求，选择适当的封闭剂。
05第五步：抗体孵育
1.抗体孵育原理


▲一抗识别膜上蛋白或修饰性抗原表位，二抗识别一抗恒定区从而与一抗结合，最终通过二抗携带的荧光或酶显色信号，达到对样本中目的蛋白进行检测的目的。
2.抗体如何选择对于任何一种目的蛋白，都有不止一种有效抗体；为缩小选择范围，我们通常考虑以下几个方面：

①文献引用：根据官网了解该抗体发表文献的数量，如果发现该靶点的抗体有多个货号，那么尽可能选择发表文献较多的货号。

②反应性：根据自己实验动物的种属性选择合适的抗体，比如，实验动物是小鼠，那么一抗需要选择抗小鼠。

③实验应用：根据自己实验类型选择厂家验证过的抗体，尽可能选择的抗体能够满足多种类型实验，保证抗体的使用价值。

④抗体偶联物：标签结合在抗体上使抗体的结合可见，选择标签抗体以检测方法的为依据进行选择。一般推荐使用HRP标记二抗，不建议使用碱性磷酸酶（AP）标记二抗，因其不够灵敏。在二抗种类的选择上，二抗应来源于产生一抗的物种。3.抗体孵育、洗涤注意事项一抗孵育、洗涤：
a.将一抗用Western Antibody Dilution Buffer按照合适比例进行稀释；
b.封闭结束后，将稀释好的一抗工作液倒入孵育槽中,室温2h或4°C过夜。
c.一抗孵育结束后，加入TBSTBuffer洗涤4次，5min/次；

二抗孵育、洗涤：
a.一抗洗涤结束前10min，将二抗用Western Antibody Dilution Buffer按照合适比例进行稀释；
b.洗涤结束后，将稀释好的二抗工作液加入孵育槽中，室温1h；
c.二抗孵育结束后，加入TBSTBuffer洗涤4次，5min/次。

抗体稀释小tips：
按照抗体说明书建议的稀释倍数进行稀释使用，有时一抗和二抗的最佳浓度也取决于检测试剂的灵敏度。一般来说，高倍稀释一抗可减少非特异性信号，高倍稀释酶标二抗可最大限度降低整体的高背景。
06第六步：ECL显影
1.显影的原理Western Blot实验的最后一步，是显影。拿到高特异性、低背景的显色图像，这一步至关重要。

显色的原理是实验中的二抗被HRP（辣根过氧化物酶）标记，可采用增强化学发光法（ECL）。ECL灵敏度高、重复性好，是目前主流的WB显色方法。
2.具体显影步骤


▲(1) 在避光环境中，将 ECL 化学发光试剂 A 液、B 液 1:1 配置，充分混匀；
(2) 将 PVDF 膜置于化学发光成像仪载物台上;
(3) 用移液器吸取适量 ECL 混合液滴在 PVDF 膜上，确保工作液均匀覆盖在整张印迹膜上;
(4) 推入载物台，设置曝光时间进行图片采集 (可设置不同的曝光时间采集图像，从中选取曝光效果最佳的图像)。

WB实验常见问题汇总
1.WB实验常见问题汇总由于WB实验时间长、细节多，从样品制备到显影，每个步骤中都可能存在问题。这里为大家汇总了实验常见问题：

①为什么我的细胞提取液中没有目标蛋白？
a) 你的细胞中并不表达这种蛋白质，换一种细胞或查文献弄清楚；
b)你的细胞中的蛋白质被降解掉了，你需要加入PMSF，抑制蛋白酶活性；
c) 你的抗体不能识别目的蛋白，检查抗体说明书，看是否有问题。

②我的细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？
a)有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS的浓度，同时将样品煮沸时间延长，一般需96℃以上10-15min左右；
b) 也不排除你的抗原浓度过高，这时需再加入适量上样缓冲液。

③我做的蛋白质分子量很小(10KD左右)，请问怎么做WB？
尽量选择0.2μm的膜，缩短转移时间；也可将两张膜叠在一起再电转。

④我的目的带很弱，怎么加强？
最主要是加大抗原上样量；同时也可以将一抗稀释比例上调。

⑤胶片背景很脏，有什么解决方法？
减少抗原上样量，降低一抗浓度，改变一抗孵育时间和温度(尽量4℃过夜，此孵育条件比37℃1h要温和很多)，并提高封闭液浓度。

⑥我在显影液中显影1分钟和5分钟后,底片漆黑一片，是什么原因呢?
a) 可能是红灯造成的, 胶片本来就被曝光了，可以在完全黑暗的情况下操作，看是否有改善.；
b) 显影时间过长，一般3-5分钟就够了，特殊情况需摸索显色时间。
2.WB条带常见问题①无特异性条带原因分析


a）一抗二抗是否使用正确？
种属：一抗是否适用于样本种属；二抗是否匹配一抗；
孵育时间和用量不足；
如没问题，4度过夜，抗体浓度提高2-4倍；

b）蛋白上样量是否足够？
蛋白上样量过低，需要增加上样量；

c）转膜是否充分、完全、过度？
充分：膜与转膜缓冲液浸润以及和胶的充分接触，可用丽春红S检测，避免甲醇浓度过高抑制蛋白转移；
完全：分子量越大时间越长；
过度：小分子量的降低转膜电压或时间；

d）洗膜或封闭过度
降低洗膜次数；
更换或降低封闭剂浓度，减少封闭时间；
更换抗体稀释液，由脱脂奶粉换成BSA；

②高背景（有条带但是背景不正常）


a）一抗或二抗问题
降低抗体浓度和孵育温度；
避免抗体和封闭剂的非特异性结合（磷酸化抗体和牛奶）；

b）封闭不完全
BSA换成5%脱脂奶粉；
提高牛奶浓度；
延长封闭时间；

c）洗涤不充分（非特异性结合没有被完全洗掉）
提高洗涤次数；
提高吐温20浓度；

d）曝光时间过长（条带过黑过粗）
减少曝光时间；
延迟曝光时间；

e）膜的选择（当背景还是很高）
NC膜>PVDF膜，相比之下NC膜背景更低；

f）蛋白降解
加入蛋白酶抑制剂（可以翻倍加）；
制样冰上操作；
用新鲜样本；

g）上样量过多（条带粗1秒曝出）
减少上样量；

③显色不均匀，负片


a）蛋白量过多
降低蛋白上样量；

b）一抗二抗浓度过高
加大抗体稀释度；
3.正常条带示例


▲正常条带示例图，希望大家看完以上内容，都能拥有这样好看的结果图。

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