冰冻切片免疫荧光（IF）实验标准操作规程

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• 冰冻切片固定：冰冻切片室温晾干，置于冷丙酮固定10 min，于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。
  
• 抗原修复：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液（PH9.0）的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。中低火10-15 min，断电间隔10 min转至中低火10-15 min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。(修复液和修复条件根据组织来确定）
  
• 阻断内源性过氧化物酶：切片放入3%过氧化氢溶液，室温避光孵育25 min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。
  
• BSA或者血清封闭:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），在圈内滴加用3%BSA或者10%正常兔血清均匀覆盖组织，室温封闭30 min。（一抗是山羊来源用10%正常兔血清封闭，一抗其它来源的用3%BSA封闭）
  
• 加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）
  
• 加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。切片稍甩干后在圈内滴加组化试剂盒内与一抗相应种属的二抗（HRP标记）覆盖组织，室温孵育50 min。
  
• DAB显色：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。
  
• 复染细胞核：Harris苏木素复染3 min左右，自来水洗，1%的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，氨水返蓝，流水冲洗。
  
• 脱水封片：将切片依次放入75%酒精6 min-85%酒精6 min--无水乙醇Ⅰ6 min -无水乙醇Ⅱ6 min-二甲苯Ⅰ5 min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。
  

冰冻切片免疫组化实验结果判读
苏木素染细胞核为蓝色，DAB显出的阳性表达为棕黄色。

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