请问为什么构建载体时，转化过后不长菌?

幸福侠侣

请问为什么构建载体时，转化过后不长菌?
原文地址：https://www.zhihu.com/question/455850705

同花顺

构建载体时，转化过后不长菌可能由多种原因造成，以下是一些常见的问题及建议：

1. 转化效率低：感受态细胞的质量直接影响转化的成功率。确保使用高质量、高转化效率的感受态细胞，并确认其在使用前未受损或失活。

2. 连接效率低：目的基因片段和载体可能没有正确地连接。检查酶切是否完全且正确，粘性末端是否匹配良好。优化连接条件，如调整DNA片段与载体的比例（推荐比例为1:5至1:10），并确保连接反应的温度和时间适宜。

3. 载体自连：如果载体自身闭合而没有插入目的基因，可能导致转化后不长菌。可以使用磷酸酶处理载体，去除末端磷酸基团，减少自连几率。

4. 抗生素抗性问题：确认选用的抗生素是否正确，以及其浓度是否适合筛选转化子。过高的抗生素浓度可能会杀死所有细胞，包括转化成功的细胞。

5. 复苏和涂板过程：复苏时间可能不够长，可以尝试延长复苏时间（例如1小时或更久）后再涂板。同时，确保涂板操作中温度适宜，避免高温烫死细菌。

6. 操作失误：检查所有实验步骤是否有误，如是否正确添加了所有必要的试剂，操作过程中是否有污染等。

7. 质粒稳定性：某些质粒在特定宿主中可能不稳定，考虑更换宿主菌株。

8. DNA纯化：确保PCR产物或酶切产物经过充分纯化，去除可能抑制转化的酶、盐分和其他杂质。

如果以上均无明显问题，可能需要重新设计实验策略，如尝试不同的酶切位点、使用不同的连接酶或改变载体设计。此外，进行对照实验（如使用阳性对照质粒进行转化），可以帮助定位问题所在。

同花顺

提要：没长出来先考虑下转化和复苏过程有没有问题。
如果平板上没有长出克隆，需要先考虑连接的问题，如果质粒连接方面没有问题（双酶切切口正确，插入片段粘性末端匹配）。接下来需要从质粒的转化过程优化。
针对连接/重组效率低的质粒有以下两种优化环节：
①延长复苏时间
按常规流程，质粒加入化学感受态中，冰浴20-30min，然后接着完成热激45s和冰浴冷却3min。在涂板之前可以放置37℃摇床中培养，这个过程又称为“复苏”。适当进行延长复苏时间，可以让重组质粒在大肠杆菌中得到充足的时间启动抗性基因（Amp）的表达，提高涂板后在氨苄压力下的存活。建议先从1h，1.5h和2h的三个时间点进行复苏，分别涂板测试。
②更换转化的感受态
有些情况下由于感受态种类不同，导致转化效率有差异。如果转染的质粒中含有同源臂或长的重复序列，通常会选择Stbl3转化，避免质粒发生重组。这个策略固然是好，但是由于Stbl3的转化下效率低，实际情况下即便提高了重组质粒的摩尔量也未必长出克隆。因此需要先用DH5α进行转化，确保有克隆可以挑取，进行菌液PCR鉴定和测序。



换两部法进行转染，提高效率

尤其是大质粒（＞10k）的情况，优先确保能转化成功，毕竟重组也是有概率的，并非转至DH5α中的载体就一定会发生重组导致构建失败。因此，在效率和准确性上可以做平衡。以上方案的策略真是：先采用转化效率高的感受态，得到测序正确的质粒后转化至稳定的感受态中，扩增和保菌。
*注意：DH5α转化阶段的菌液不必保存，后续质粒扩增也不需要用到它，继续使用反而增加质粒被重组的可能。
挑出克隆后，尽量先培养一段时间（2-4h），然后取1-2μl的菌液进行菌液PCR。平板上的克隆越多，则尽量多挑选克隆培养并进行菌液PCR，减少假阳性所带来的影响。



设置阴性对照，挑5-10个克隆进行菌液PCR

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继续前进

可能载体上的抗性基因没有起作用，或者根本没有转进去。也有可能接种量太小了，你把500-700μL菌液全部倒进平板试试看，究竟是没有还是太少。