流式细胞术分析细胞周期的实验步骤

Rose

流式细胞术是一种很常见的实验方法，对于细胞周期来说，一般是采用经典的碘化丙啶（PI）染色的方法进行周期分析， PI可以和双链DNA结合产生荧光，荧光强度和DNA含量呈正比，因此，我们可以根据DNA含量的多少来进行细胞周期的分析。接下来以我个人做周期的经验来分享实验步骤及注意事项。
实验步骤
1.按照实验要求进行细胞铺板，待细胞长到需要的密度收细胞。
2.收细胞步骤和普通处理细胞相同，需要注意的是在做细胞周期时，需要将原培养基收集到离心管内，消化时间到后加入原培养基中止消化，最后一起离心。
3.离心完后去掉上清，加入1ml冰浴的PBS缓冲液重悬，并转移到1.5ml Ep管内，低温离心机4℃、1000g离心5min，去上清，可剩余约50μl，轻弹离心管底适当分离细胞。
4.将分散的细胞悬液加入1ml冰浴预冷的70%酒精中，轻轻吹打混匀，冰箱4℃固定最少4h。
5.取出固定的细胞，低温离心机4℃、1000g离心5min，去上清后加入1ml预冷的PBS缓冲液重悬细胞，再次离心，去上清，可剩余50μl PBS缓冲液，轻弹管底以分离细胞。
6.染料配置：根据样本的多少按说明书配置染料，全程在避光的环境下进行。
7.每管样品中加入500μl碘化丙啶染液，用加样枪缓慢混匀，37℃避光孵育30min，完成后上流式细胞仪检测保存数据，进行后续处理。



注意事项
1.收细胞的密度根据个人需要，若有铺细胞后随着时间推移出现细胞变圆、死亡等细胞减少的现象，则推荐种板时最小选择六孔板，在收细胞以及后续用PBS缓冲液洗细胞时都会损失部分细胞，若细胞量过少（最后染色前几乎看不到细胞沉淀），会导致上机检测速度过慢，收细胞困难。
2.在开始收细胞前，应提前准备好冰浴的PBS及70%酒精，一般情况下，70%酒精需要用超纯水对95%的酒精进行稀释而来。同时，也要注意冰浴的PBS缓冲液用来洗细胞沉淀，但在加胰酶消化前使用的PBS缓冲液是37℃温浴过的。
3.酒精固定细胞时，是将细胞悬液加入酒精中，不是在细胞悬液中加入酒精。
4.酒精固定细胞推荐4℃冰箱过夜，效果会更好。
5.染料配置完成后，按比例加入细胞打孔剂triton，因triton较粘，建议吸样时减去前面半截枪头，打到最低档进行吸样，确保吸上了triton。
6.周期染料为光敏物质，除了配置时需要避光外，在上机前的所有操作都应避光。
7.在上机前，需要将Ep管中的样品过滤到流式管内，过滤网可选择200目的规格。

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本文作者是&#34;吴大宝&#34;同学，在获得授权后，实验老司机将本文发表于公众号。
文稿：吴大宝
校对：煲仔饭
参考资料：

• https://images.app.goo.gl/UQgW9vH8wiomuZt78
  
• https://cancer.wisc.edu/research/wp-content/uploads/2017/08/Flow_TechNotes_Cell-cycle-analysis_20170918.pdf
  

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/687165578