流式细胞术原理、应用及分析整理——（补偿调节）

John

上次文章中我们对阳性、阴性对照的设置进行了介绍和讲解。今天我们将对补偿调节的相关知识进行讲解
<hr/>补偿调节的原理

• 原理：流式荧光通道之间需要调节补偿主要是因为流式荧光素在相应激光激发后发射的荧光波长并不是完全集中于一个很小的范围。（并不是一个荧光信号只能被一个通道吸收，也可能被其他范围内的通道吸收）
  
• 示例：FITC荧光素，激发光长度为488nm，发射后的荧光信号集中在80%集中于510-550nm，处于FL1通道之中，表示FITC所发射的荧光信号80%被FL1接收，而10%位于565-595nm，被第2荧光信号通道（FL2）接收，剩余的10%既不被FL1和FL2接收。PE荧光素在488nm激光激发后发射的荧光信号85%集中于565-595nm，也就是FL2荧光范围，其余的5%被FL1通道吸收，另外10%既不被FL1和FL2接收
  
• FL1接收到的荧光信号代表FITC荧光素信号，也称为FITC通道，FL2接受到的信号代表PE荧光素的信息，称为PE通道。当只标记FITC偶联的抗体时，当样本中存在相应抗原分子后，FL1通道即接受到FITC荧光素所激发的荧光信号，占80%，但FL2同时也能接受到荧光信号，占10%。由于只标记了FITC偶联抗体，并不需要考虑FL2的荧光信号。当多色分析时，如同时标记FITC和PE时，就需要让FL1只代表FITC，让FL2只代表PE的荧光信号
  
• FL2-FL1表示排除FL2中来自FL1的荧光信号值（需要看哪个通道，放在减号前面。需要排除的干扰荧光信号放在减号后面）
  

具体方法

以下图为例，此图是调节FITC（FL1通道）和PE（FL2）通道之间调节补偿的过程



补偿调节图

• 样本细胞：小鼠脾脏细胞
  
• 抗体：FITC-抗小鼠CD8抗体、PE-抗小鼠CD4抗体
  
• 样本数：4个
  
• 第一份样本——不标记任何的荧光素偶联抗体，仅作为阴性对照，用于确定PE和FITC的阴阳分界线
  
• 第二份标本——只标记FITC-抗CD8抗体，用于调节PE-FITC通道，未调节时的图如图A所示，从图中可见，不仅FITC通道能够接受到FITC荧光素所发射的荧光信号，PE通道也能接受到FITC荧光素所发射的荧光信号，此时就需要设置PE-FITC补偿（PE减FITC补偿）。图B是正确设置了PE-FITC补偿值，PE通道基本上接收不到FITC信号，FITC阳性和阴性细胞基本都处于同一水平线上。图C明显为过度调节，FITC阳性细胞群PE通道信号值明显低于FITC阴性细胞
  
• 第三份标本——只标记PE-CD4抗体。图D是未调节时的FITC-PE散点图，从图中可见，FITC通道也接收到了PE荧光素所发射的荧光信号，为了消除FITC中PE的荧光信号所以需要设置FITC-PE补偿值。图E是正确调节FITC-PE补偿值后的FITC-PE散点图。图F是过度调节FITC-PE补偿值的散点图
  
• 第四份样本——同时标记FITC-CD8和PE-CD4抗体，图G是未调节补偿的散点图，图H是正确调节后的散点图，图I是过度调节后的散点图
  

调节注意事项

• 调节荧光通道之间的补偿需要有两种荧光素偶联抗体（两抗体）
  
• 所选择的两个抗体所结合的抗原分子必须在样品细胞中有明确的表达，且表达该抗原的细胞数占较高的比例（大于10%，不高于50%）
  

影响补偿大小的因素

• 流式细胞仪的型号：不同流式细胞仪用滤片分离荧光的方法不同，且不同型号之间所接受的荧光信号范围有所不同，因此补偿值没有固定范围，不能将一台仪器荧光通道之间的补偿值直接应用于另一台荧光仪器上
  
• 荧光素偶联抗体：荧光素发射的荧光波长不是绝对集中的，如FITC荧光素发射的荧光大部分被FL1所接收但小部分被FL2通道所吸收，所以就需要我们调节补偿。如果荧光素发射的波长绝对的集中那么荧光素就只能被所对应的通道接收，不需要再进行调节。补偿不是通道之间的补偿而是荧光素之间的补偿
  
• 细胞的大小：细胞的理化性质相差较大时，使用相同的通道时，各通道之间的补偿可能不同所以当细胞理化性质差异较大时，最好重新调节新的样品细胞的补偿
  

<hr/>今天我们主要讲解了流式细胞术中补偿调节的相关问题，下面我们将讲解阈值的设定和流式分析中死细胞的问题

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