关于western blot我们应该知道些什么？

空白派 · 发表于 2025-3-3 13:10

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关于western blot我们应该知道些什么？
原文地址：https://www.zhihu.com/question/458819718

清风寡欲 · 发表于 2025-3-3 13:11

WB作为分子生物学中最常用的实验，包含了很多技巧与知识，想做出漂亮的WB检测结果不是一件易事。
本文针对WB实验各步骤展开了详细解读，包含实验原理及流程、具体操作、注意事项、WB配套产品推荐等。内容较长，可结合小标题查看。
我们还汇总了59个WB实验常见问题&5个条带问题分析放的word文档，大家可以在本文第三部分内容自行下载。
一、WB实验简介

1、WB实验原理

免疫印迹（Immunoblotting）又称为蛋白质印迹（Western Blot，WB），是一种综合性的免疫学检测技术，用于检测细胞或组织提取物中的蛋白表达水平。
这项技术利用待检测蛋白与抗体的特异性结合，测定生物样本中的蛋白水平，已经被广泛应用并得到公认。
目前，WB技术已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。WB实验一般分为SDS-PAGE样本制备、凝胶电泳、转膜、封闭、抗体孵育及免疫检测等步骤。

WB实验原理示意图（图片来源于网络）

2、WB实验常见流程

WB标准流程：样本制备→凝胶上样、电泳→转膜→封闭→抗体孵育→显影

WB标准流程图（图片来源于网络）

3、WB实验前准备阶段

实验前需要了解重要信息
实验开始前一定要做的事情，是对所研究的目的蛋白在待测样本中的表达水平、蛋白大小、翻译后修饰等背景信息进行深入的了解，同时也需要设置严格的阴性、阳性对照样本。这将有助于在实验出现异常结果时进行排查分析。
通常我们会参考文献或数据库进行样本的选择，下面列举几个常见数据库：
该蛋白在什么组织中表达？
1）网址：http://www.biogps.org
通过mRNA表达水平给您参考估计不同样本中目的蛋白的表达水平；样本种属可以选择人、小鼠、大鼠等。还可以链接其他的数据库。
2）网址：http://www.proteinatlas.org
简称HPA数据库，提供人类蛋白质在组织和细胞的分布，并用免疫组化技术。
该蛋白有没有其他的修饰形式？
1）网址：http://www.uniprot.org
了解目的蛋白的基因名、别名、功能、可变剪切体、蛋白表达位置、可修饰类型等。
2）网址：http://www.phosphositeplus.org
是蛋白质翻译后修饰权威数据库，查阅修饰类蛋白的表达条件和丰度、刺激方式等。
还想知道该蛋白的具体信息？该蛋白的实验图？有无该蛋白的抗体？更多相关内容查看往期文章常用Western Blot数据库网站了解一下

4、WB实验流程重点分享

第一步：样本制备

1）样本制备4个步骤
样本制备分为样本获取、蛋白裂解、蛋白定量、蛋白定性等4个关键步骤。
①样本获取：组织或细胞取材；
②蛋白裂解：从组织或者细胞中释放获取蛋；
③蛋白定量：获悉蛋白浓度，为后续电泳步骤提供上样量依据；
④蛋白变性：使蛋白变性形成线性结构，方便跑胶和抗体结合。
更多样本制备步骤详细步骤我们也写过，可查看往期文章 WB全攻略之蛋白样本制备
普通蛋白WB做的得心应手，磷酸化的蛋白却怎么都做不出来？查看往期文章磷酸化蛋白Western Blot最容易忽略的几个问题，我们整理好了
2）样本制备之裂解液的选择

▲组织和细胞破碎过程中常用的裂解液为RIPA裂解液，其中根据蛋白性质的不同，我们选择的裂解液也不同。
更多裂解液选择方式可查看往期文章 RIPA裂解液，你选对了吗？

第二步：凝胶上样、电泳

1）操作须知
①凝胶制备：
聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。
它有两种形式：SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）及非变性聚丙烯酰胺凝胶（Native-PAGE）。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺聚合而成，形成一个三维网状的结构，它具有分子筛效应。

②上样与电泳：
a）蛋白预染Marker：采用预染色标记可以看见电泳过程中蛋白迁移的距离，为了便于观察电泳效果与转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，在电泳时通常要使用预染的蛋白分子量标准。根据待测蛋白的分子量大小，挑选合适的Marker。
b）加入足量的样品：SDS-PAGE根据蛋白电泳迁移率将其分离，迁移率是蛋白大小和电荷的函数。我们建议在预制Tris-Glycine小孔胶上样20-30μg总蛋白或100ng纯蛋白；对于组织，我们通常建议上样量最多100μg总蛋白，具体取决于靶标表达水平；但是，如果蛋白水平低于检测值，在电泳之前可能还需要进行免疫沉淀以富集待测蛋白。
c）尽量保持每个泳道的蛋白量一样，体积尽量一致，方便后续观察蛋白的表达量。
d）空置的泳道用等体积的1x Loading Buffer补齐，防止最后的一两个样品条带上扬。

自制凝胶时的注意事项？上样与电泳时还会出现哪些问题？更多相关内容查看往期文章 WB实验中，上样与电泳注意事项

第三步：转膜

1）转膜原理
蛋白质经SDS-PAGE分离后，必须及时从凝胶中转移到固相支持物上，固相支持物能牢固结合蛋白又不影响其抗原活性，这使其比直接在凝胶上检测更易操作。蛋白质从凝胶向膜转移的过程常采用电转印法包括湿转和半干转，与SDS结合的蛋白带有负电，在电场中向正极迁移，并最终结合在固相支持物上。
2）膜的选择

▲现阶段常用的转印膜主要是PVDF膜、NC膜这2种，PVDF膜可以提供更好的蛋白截留率、物理强度和广泛的化学兼容性。
3）转膜方法

▲转膜的方法分为：湿转、半干转、干转，其中湿转是转膜最完全、应用最广的方法。
4）转膜必看注意事项
①大分子量蛋白：转膜缓冲液里加入0.1%的SD5；甲醇浓度降到10%甚至更少，用4℃湿转过夜代替半干法转膜；增加转膜时间、电流/电压；
②小分子量蛋白：去净缓冲液里的SDS；保持甲醇浓度在20%；用小孔径的膜；降低转膜时间、电流/电压；
③膜的方向确定: 转移后剪角做标记，分清正反面；用铅笔做记号或电泳时Marker上成非对称的；
④转膜后背景高: 选择NC膜；
⑤转膜时污染: 避免手指触碰膜，可以用镊子来取膜，油脂和蛋白质会弄脏膜；
⑥滤纸的大小：确保滤纸和膜的大小与胶一致，当使用半干法转膜时，过多的部分会阻碍电流穿过膜。

第四步：膜封闭

1）封闭的目的

▲转印结束后，必须将对印迹膜上未被占据的蛋白结合位点封闭掉以防止非特异性探针结合。如果没能将膜上位点全部封闭将会导致印迹膜出现比较高的背景，因为很多检测探针也是蛋白，也会与膜结合。（图片来源于网络）
2）封闭液的选择
通常有两种常用的封闭剂，牛血清白蛋白（BSA）和脱脂奶粉。
一般来说，脱脂奶粉的封闭效果更强，但有时 BSA 比脱脂奶粉更有利于降低非特异性背景，而有些抗体则在脱脂奶粉封闭的情况下才能得到清晰的背景。
脱脂奶粉：性价比较高；通常使用浓度为2.5%~5%；不能用于磷酸化蛋白，因为脱脂奶粉中的酪蛋白本身是一种磷酸化蛋白，会结合磷酸化特异性抗体而易产生高背景。
牛血清蛋白（BSA）：通常使用浓度为2%~5%；某些抗体用BSA封闭会产生比脱脂牛奶更强的信号，确定抗体使用的特殊需求，选择适当的封闭剂。

第五步：抗体孵育

1）抗体孵育原理

▲一抗识别膜上蛋白或修饰性抗原表位，二抗识别一抗恒定区从而与一抗结合，最终通过二抗携带的荧光或酶显色信号，达到对样本中目的蛋白进行检测的目的。
2）抗体如何选择
对于任何一种目的蛋白，都有不止一种有效抗体；为缩小选择范围，我们通常考虑以下几个方面：
①文献引用：根据官网了解该抗体发表文献的数量，如果发现该靶点的抗体有多个货号，那么尽可能选择发表文献较多的货号。
②反应性：根据自己实验动物的种属性选择合适的抗体，比如，实验动物是小鼠，那么一抗需要选择抗小鼠。
③实验应用：根据自己实验类型选择厂家验证过的抗体，尽可能选择的抗体能够满足多种类型实验，保证抗体的使用价值。
④抗体偶联物：标签结合在抗体上使抗体的结合可见，选择标签抗体以检测方法的为依据进行选择。一般推荐使用HRP标记二抗，不建议使用碱性磷酸酶（AP）标记二抗，因其不够灵敏。在二抗种类的选择上，二抗应来源于产生一抗的物种。
3）抗体孵育、洗涤注意事项
一抗孵育、洗涤：
a.将一抗用Western Antibody Dilution Buffer按照合适比例进行稀释；
b.封闭结束后，将稀释好的一抗工作液倒入孵育槽中,室温2h或4°C过夜。
c.一抗孵育结束后，加入TBSTBuffer洗涤4次，5min/次；
二抗孵育、洗涤：
a.一抗洗涤结束前10min，将二抗用Western Antibody Dilution Buffer按照合适比例进行稀释；
b.洗涤结束后，将稀释好的二抗工作液加入孵育槽中，室温1h；
c.二抗孵育结束后，加入TBSTBuffer洗涤4次，5min/次。
抗体稀释小tips：
按照抗体说明书建议的稀释倍数进行稀释使用，有时一抗和二抗的最佳浓度也取决于检测试剂的灵敏度。一般来说，高倍稀释一抗可减少非特异性信号，高倍稀释酶标二抗可最大限度降低整体的高背景。

第六步：ECL显影

1）显影的原理
Western Blot实验的最后一步，是显影。拿到高特异性、低背景的显色图像，这一步至关重要。
显色的原理是实验中的二抗被HRP（辣根过氧化物酶）标记，可采用增强化学发光法（ECL）。ECL灵敏度高、重复性好，是目前主流的WB显色方法。
2）具体显影步骤

在避光环境中，将 ECL 化学发光试剂 A 液、B 液 1:1 配置，充分混匀；
将 PVDF 膜置于化学发光成像仪载物台上;
用移液器吸取适量 ECL 混合液滴在 PVDF 膜上，确保工作液均匀覆盖在整张印迹膜上;
推入载物台，设置曝光时间进行图片采集 (可设置不同的曝光时间采集图像，从中选取曝光效果最佳的图像)。

二、WB实验常见问题汇总

1）59个WB实验常见问题

由于WB实验时间长、细节多，从样品制备到显影，每个步骤中都可能存在问题。这里为大家汇总了实验常见问题：
①为什么我的细胞提取液中没有目标蛋白？

你的细胞中并不表达这种蛋白质，换一种细胞或查文献弄清楚；
你的细胞中的蛋白质被降解掉了，你需要加入PMSF，抑制蛋白酶活性；
你的抗体不能识别目的蛋白，检查抗体说明书，看是否有问题。

②我的细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？

有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS的浓度，同时将样品煮沸时间延长，一般需96℃以上10-15min左右；
也不排除你的抗原浓度过高，这时需再加入适量上样缓冲液。

③我做的蛋白质分子量很小(10KD左右)，请问怎么做WB？
尽量选择0.2μm的膜，缩短转移时间；也可将两张膜叠在一起再电转。
④我的目的带很弱，怎么加强？
最主要是加大抗原上样量；同时也可以将一抗稀释比例上调。
⑤胶片背景很脏，有什么解决方法？
减少抗原上样量，降低一抗浓度，改变一抗孵育时间和温度(尽量4℃过夜，此孵育条件比37℃1h要温和很多)，并提高封闭液浓度。
⑥我在显影液中显影1分钟和5分钟后,底片漆黑一片，是什么原因呢?

可能是红灯造成的, 胶片本来就被曝光了，可以在完全黑暗的情况下操作，看是否有改善.；
显影时间过长，一般3-5分钟就够了，特殊情况需摸索显色时间。

篇幅有限，更多WB实验问题请至本文第三部分内容领取整理好的word文档

2）5个WB条带常见问题

WB实验过程中常见条带问题分析，有图有真相，也欢迎大家留言讨论！
①WB无条带怎么自查？
查抗体？查说明书？实验自查？更多相关内容请查看往期文章 WB无条带自查大法
②WB条带大小不正确怎么自查？
查源头样本？查目标蛋白isoform形式？更多相关内容请查看往期文章 WB条带大小不正确自查大法
③无特异性条带原因分析

a）一抗二抗是否使用正确？
种属：一抗是否适用于样本种属；二抗是否匹配一抗；
孵育时间和用量不足；
如没问题，4度过夜，抗体浓度提高2-4倍；
b）蛋白上样量是否足够？
蛋白上样量过低，需要增加上样量；
c）转膜是否充分、完全、过度？
充分：膜与转膜缓冲液浸润以及和胶的充分接触，可用丽春红S检测，避免甲醇浓度过高抑制蛋白转移；
完全：分子量越大时间越长；
过度：小分子量的降低转膜电压或时间；
d）洗膜或封闭过度
降低洗膜次数；
更换或降低封闭剂浓度，减少封闭时间；
更换抗体稀释液，由脱脂奶粉换成BSA；
④高背景（有条带但是背景不正常）

a）一抗或二抗问题
降低抗体浓度和孵育温度；
避免抗体和封闭剂的非特异性结合（磷酸化抗体和牛奶）；
b）封闭不完全
BSA换成5%脱脂奶粉；
提高牛奶浓度；
延长封闭时间；
c）洗涤不充分（非特异性结合没有被完全洗掉）
提高洗涤次数；
提高吐温20浓度；
d）曝光时间过长（条带过黑过粗）
减少曝光时间；
延迟曝光时间；
e）膜的选择（当背景还是很高）
NC膜>PVDF膜，相比之下NC膜背景更低；
f）蛋白降解
加入蛋白酶抑制剂（可以翻倍加）；
制样冰上操作；
用新鲜样本；
g）上样量过多（条带粗1秒曝出）
减少上样量；
⑤显色不均匀，负片

a）蛋白量过多
降低蛋白上样量；
b）一抗二抗浓度过高
加大抗体稀释度；
篇幅有限，更多WB条带问题请至本文第三部分内容领取整理好的word文档！

3）正常条带示例

▲正常条带示例图，希望大家看完以上内容，都能拥有这样好看的结果图。

三、资料下载

WB常见问题汇总：《59个WB实验常见问题+5个条带问题分析》文档及wb结果图灰度分析工具下载！

四、WB实验相关产品

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卡卡 · 发表于 2025-3-3 13:11

看了大家的回答大部分都在讲western blot的实验原理，那我补充一下其它回答内没有说到的：在做western blot之前，有哪些是我们该去了解的，这非常重要！
<hr/>在实验开始前，有必要对所研究的目的蛋白进行全面的了解。
常言道知己知彼，方能百战百胜。
WB实验中目的蛋白基本信息如何查询？这9个数据库帮你理清楚所有信息！

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一、该蛋白在什么细胞／组织中表达

BioGPS

网址：http://biogps.org/#goto=welcome
BioGPS是一个免费的统筹和查询基因注释的新资源，其基因注释包含了公共资源的信息及诺华研究部门所生成的数据。适用于查询某一基因在不同组织和细胞的表达情况。
BioGPS操作很简单，通过目标基因进行检索，样本种属可以选择人、小鼠、大鼠、果蝇等。

<hr/>以P53为例，human来源，选择TP53。
在详细信息页面可通过Zoom来调节柱状图的高度，使观察差异更加明显。
BioGPS默认有6个数据库和3028个数据文库，可以自行选择。然后将结果界面向下拉，还可看到链接到GENE WIKI,详细了解基因的功能介绍以及相关参考文献。
通过柱状图可以看到不同细胞系中TP53的表达情况，下图看出TP53在721B淋巴细胞中表达量最高。

<hr/>2.The Human Protein Atlas
https://www.proteinatlas.org/
Human Protein Atlas（HPA）提供了两万多种人类蛋白质的组织和细胞分布信息。在这个数据库中，研究人员通过免疫检测技术（免疫印迹、免疫荧光和免疫组化），检测了每一种蛋白在不同细胞系、正常组织和肿瘤组织中的表达情况。这是一个大规模蛋白质研究项目，主要目的是绘制人体组织和细胞中表达基因编码的蛋白位置。不过这个网站只针对人类蛋白质。

HPA数据库可以分为Subcellular、Tissue和Pathology三个版块，分别展示了蛋白在细胞、正常组织和肿瘤组织中的表达情况。
p53为例，这里主要看下Subcellular板块。

<hr/>“Subcellular”版块共分7个部分，即SUBCELLULAR、RNA EXPRESSION、HUMAN CELLS、SINGLE CELL VARIATION、siRNA、GENE/PROTEIN和ANTIBODIES AND VALIDATION，详细介绍了p53的相关信息。
主要提供了细胞的蛋白表达情况，其中比较关键的信息是蛋白在不同细胞、以及同一细胞内的空间分布情况，这些数据以免疫检测实验结果展示，为后续实验参考提供了极大的便利。

<hr/>二、该蛋白有无其他的修饰形式

1.PhosphoSitePlus
https://www.phosphosite.org/
PhosphoSitePlus当中关于翻译后修饰的信息主要来自于具体的实验结果以及高通量测序的预测。数据库也提供了原始数据下载的过程。可以下载了自己 DIY 结果。
对于翻译后修饰主要修饰类型，在 PhosphoSitePlus 基本都能预测，包括磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化等。
它可以查阅修饰类蛋白的表达条件和丰度、刺激方式等。

<hr/>2.uniprot
https://www.uniprot.org/
Uniprot的数据主要来自于基因组测序项目完成后获得的蛋白质序列，并包含了大量来自文献的蛋白质的生物功能信息。如了解目的蛋白的基因名、别名、功能、可变剪切体、蛋白表达位置、可修饰类型等。

亚细胞结构：

可变剪切体：

翻译后修饰情况：

<hr/>三、该蛋白的具体信息

1.Expasy
https://www.expasy.org/
Expasy主要包括蛋白质序列、构造及2-D PAGE (Two-dimentional polyacrylamide gel electrophoresis ) 的多个重要资料库，还提供了蛋白质序列和构造工具，FTP Server 和相关讯息。

<hr/>2.NCBI
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
NCBI作为大名鼎鼎的科研信息数据库，除我们常用的Pubmed文献检索外，还有另一个强大的功能，用gene查询蛋白质信息。
以查询“CD47”为例，在详细信息结果页面中，可以看到这个蛋白的简介，一直往下拉可以看到其他的信息如：基因信息、在染色体上的位置、表达分布、相互作用以及蛋白和mRNA的序列等。

<hr/>四、该蛋白的实验图？

http://1.openi.nlm.nih.gov
国家医学图书馆的Open-i服务可以从开源文献和生物医学图像集中搜索和检索摘要和图像（包括图表，图形，临床图像等）。可以使用文本查询以及查询图像进行搜索，其搜索出来的结果全部与生物医学相关。
如我们输入关键词NF-κB，点击搜索。可以看到与NF-κB相关的免疫组化、免疫印迹、荧光染色和信号通路图等。

<hr/>2.PMC Images
www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/
美国国立卫生研究院旗下的图片数据库。以前的PMC Images没有独立的查询网站，其搜索结果伴随着Pubmed的检索而出现。
现在可以通过登录https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/直接进入PMC Images搜索页面。

<hr/>五、有无该蛋白的抗体？

citeab
https://www.citeab.com/
在生命科学和医学基础研究中，或多或少都需要用到抗体。抗体的应用场景不同、标记物众多，且针对同一标记物市场上往往有多个抗体可供选择，那么，我们如何从成百万上千万种抗体中，挑选出我们想要的那支呢？
citeab是国际知名的抗体搜索引擎，用抗体的引用数量(citations)来进行抗体排名，确保抗体排名完全透明公正。该平台目前包括来自335个供应商的699万种抗体，引用数量超过424万。
输入关键词（如：CD3）后点击搜索即可出现所有符合条件的抗体，而该网站的特色是，搜索结果根据抗体被文献引用的次数排序，一般来说，引用越多的产品，质量往往越有保证。

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写的太全了，Endnote 插入文献以及调整参考文献格式，这是知乎上最好的教程！
太牛了！Zlibrary回归，这里有最稳定的访问指南！
western blot是为了什么？
如何学习和记忆细胞信号通路？
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SPSS 27 安装激活，授权日期到期时间2037年

清风寡欲 · 发表于 2025-3-3 13:12

Part.1
一、Western blot 技术起源
1975年，Edwin Southern发明了DNA杂交检测技术，命名为Southern blot。1977年，James Alwine、David Kemp和George Stark发明了RNA杂交检测技术，命名为Northern blot。两年后位于美国斯坦福大学的George Stark发明了将蛋白从电泳凝胶上转移到活化纤维素上的技术，随后Harry Towbin发展出更快速、简单的电转技术。1981年Neal Burnette正式将这一技术命名为“Western blot”。
Part.2
Western blot 用来干什么？
（一）确定目的蛋白的表达情况
这是Western blot最常规的应用，如检测患者的标本与正常人的标本、实验条件处理后细胞与未处理的对照细胞之间目的蛋白的表达变化情况，通过灰度分析可以确定目的蛋白表达水平是升高还是降低。
（二）研究蛋白间的相互作用
这是与免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，CO-IP）技术相结合的一种检测蛋白质之间相互作用的常用方法。通过CO-IP技术将相互作用的蛋白质复合体分离出来后进行凝胶电泳，然后利用相互作用的蛋白质的特异性抗体进行检测。适用于对已知的蛋白质的相互作用进行检测，不适用于检测一个蛋白质未知的相互作用蛋白；也可以用于蛋白质-DNA、蛋白质-RNA相互作用的后续分析。
（三）确定目的蛋白的细胞定位
通过分别提取细胞不同部位的蛋白质，如膜蛋白、胞浆蛋白核蛋白或线粒体蛋白等，将分离出来的不同部位的蛋白质进行Western blot检测可以分别检测目的蛋白在不同部位的表达情况。
Part.3
Western blot实验原理
Western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过跑蛋白凝胶电泳，分离蛋白质样品，然后将凝胶转移到某种固相载体（如PVDF膜）。这个固相载体能以非共价键形式吸附蛋白质，同时能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以载体上的蛋白质或多肽作为抗原，在载体上孵育上对应的抗体进行免疫反应，然后再孵育已经标记好酶的二抗，经过底物显色来检测电泳分离的目的基因表达的特异蛋白成分。

https://www.yeasen.com/news/detail/73

我们平时说的跑蛋白胶一般就是指聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称为PAGE（polyacrylamide gel electrophoresis），聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应，有两种形式：非变性电泳（Native-PAGE）和变性电泳（SDS-PAGE）。非变性电泳（Native-PAGE），是在不加入SDS和巯基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于同工酶的鉴定和提纯。未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，它们的分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用。非变性电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性，对生物大分子的鉴定有重要意义。在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。

Polyacrylamide Gel Electrophoresis PowerPoint Presentation, free download - ID:345406 (slideserve.com)

变性电泳（SDS-PAGE），将蛋白质进行变性，令其打开折叠的空间结构，使抗体能结合到相应表位，是目前用于测定蛋白质分子量最好的方法。SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。强还原剂，如巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。有些蛋白至含有二聚体或多聚体，加入β-巯基乙醇可还原多聚蛋白之间和内部的二硫键，电泳的样品将会被完全还原成单体甚至亚基形式，不加还原剂的样品则会保持聚体的形式。由于SDS带有大量负电荷，当与蛋白质结合时，所带负电荷的量大大超过蛋白质分子原有的电荷量，因此掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差异。SDS与蛋白质结合后，还可以引起蛋白质构象的变化，使得不同蛋白质的SDS复合物在水溶液都近似于长椭圆棒，在电泳中的迁移率仅受分子量大小的影响，而不再受蛋白质原有电荷量和形状的影响，因此可测定蛋白质分子量。

https://www.antibodies.com/cn/western-blotting

Part.4
Western blot的实验流程
Day1
一、配制蛋白分离胶
（一）所需材料和试剂
配胶用玻片、配胶用夹子、梳子、15mL离心管、不同量程移液枪、吸头；
聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵（APS）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。

① 聚丙烯酰胺（30% Acr-Bis）甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构为蛋白质电泳提供载体。
配制：称取 150g Acr-Bis 粉剂(30%,w/v) ,充分溶解于400mL的去离子水,定容至终体积为500mlL,配制成溶液后应 4℃避光保存,3 个月有效。
② Tris缓冲液，pH 8.8/pH 6.8，pH变化会影响电泳的效果，所以制胶的过程要分清楚浓缩胶和分离胶的缓冲液。
配制：
1.5mol/LTris-HCl(pH8.0)：称量181.7g Tris，加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解，用浓HCl调节pH值至8.8，将溶液定容至1000ml，高温高压灭菌后，室温保存。
0.5mol/LTris-HCl(pH6.8)：称量60.57g Tris，加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解，用浓HCl调节pH值至6.8，将溶液定容至1000ml，高温高压灭菌后，室温保存。
（注：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。）
为什么有两种pH值的Tris缓冲液？Tris-甘氨酸SDS-PAGE是一种不连续电泳方法，因为需要配制两种浓度的胶：浓缩胶胶和分离胶。与分离胶相比，浓缩胶的丙烯酰胺浓度更低，pH值也更低（6.8 vs 8.8）以及离子组成不同。
蛋白在浓缩胶迁移时，蛋白质样品处于高迁移率离子Cl-和低迁移率离子甘氨酸之间，从而蛋白质发生“堆叠”，使蛋白在进入分离胶之前浓缩成一条紧密的带，相当于蛋白处于同一起跑线；
一旦蛋白质进入分离胶，甘氨酸离子的电泳迁移率很快超过蛋白质，高电势梯度也随之消失，在均一电势梯度和pH的分离胶中，蛋白质就会根据区域电泳原理“去堆叠”并迁移，由于各种蛋白质的等电点不同，所带电荷量不同，经过一定时间电泳，各种蛋白质以一定顺序排列成一条条蛋白质区带。不同蛋白质的电泳迁移率取决于它们的分子量大小。

③ 10%SDS：十二烷基苯磺酸钠（SDS）消除蛋白质电荷，解离蛋白质间的氢键，取消蛋白质分子内的疏水作用，去多肽折叠（蛋白质变性）。
配制：称取10gSDS，加入90mL双蒸水中，加热至68℃以溶解SDS结晶，定容至 100mL体积，室温保存。
④ 10%AP：催化剂，最好现配现用。
配制：称取1g过硫酸胺干粉，加入10mL双蒸水，充分混匀后分装在1.5mL EP管中，保存于-80℃冰箱，AP在室温中会逐渐分解，使用时拿出一管4℃解冻。
（注：AP 4℃可保存使用2周左右，超过期限会失去催化作用。）
⑤TEMED：增加TEMED的量，胶的凝固速度会加快，但如果增加太多，胶凝固太快有可能导致凝固不均匀。
胶浓度的选择
聚丙烯凝胶的浓度越高，胶的分子孔径就越小，同样电泳条件下分子量大的蛋白质被阻挡在外难以进入胶，而分子量小的蛋白质则可以顺利通过筛孔并留在胶上。凝胶的浓度越低，胶的分子孔径就越大，同样电泳条件下分子量大的蛋白质则可以通过筛孔并得以在胶上进行分离，而分子量小的蛋白质则快速地从筛孔中跑走。因此通常根据目标蛋白分子量的大小选择凝胶的浓度，参见下表：

配胶步骤
（1）准备2个15mL离心管，分别做好“上层胶”“下层胶”标记，可简化为“上”、“下”标记
（2）将玻璃板、隔条洗净晾干后组成严密的灌胶板，安装后倒满水用于检漏，5min水的液面不下落即可将水倒出，证明安装装置可以用于下一步使用

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（3）先配置分离胶即下层胶，按照如下配方，根据自身实验需要几块胶来选择配制体系（&#34;！&#34;表示有毒，需小心操作）

（4）混匀后将分离胶液缓慢注入两层玻璃板中，至距离玻璃板顶端约3cm处，给上层胶留出足够空间，加满水封胶，使分离胶面保持水平，同时避免产生气泡。
（敲黑板：动作别磨蹭，天气热的时候胶凝固得快，容易不均匀。除了加水封胶，也可以加乙醇或异丙醇，封胶的目的是把胶压平以及防止氧散到凝胶中抑制聚合作用）
（5）室温静置约30min，待胶凝固，把装置对着光线，当能清晰看到覆盖层和胶层中间存在一条线时，胶就凝好了。
（6）倒掉覆盖层的水，尽可能倒掉液体，用滤纸吸干水，避免滤纸直接接触到凝胶。
（7）按下表配制浓缩胶液（上层胶），缓慢加至分离胶上面，插入梳子，注意不要混入气泡，室温静置约30min

（注：加完TEMED后聚合反应就立即开始，不要耽搁，迅速混匀混合物进行下一步）
二、蛋白电泳
（一）所需材料和试剂
蛋白样品（用1×Loading buffer制备，即1×SDS凝胶上样缓冲液），电泳液，电泳仪，不同量程移液枪，吸头；
5×电泳液（Running Buffer）配制：分别称取 Tris 粉末 15.1 g、甘氨酸粉末 94g 及 SDS粉末 5 g，先用 800 ml 蒸馏水充分搅拌使之完全溶解，然后补加蒸馏水定容至 1 L，再次混匀充分，常温保存，临用时加入蒸馏水稀释为 1×工作液。
1、安装电泳装置：待胶凝固后将胶连同玻璃板从架子上取下装进电泳内槽，加样面向内，将内槽放进电泳外槽，内槽加满电泳液（注意内槽安装的密封性，防止漏液），外槽加入电泳液至内槽高度约1/3处（外槽有相应的刻度标识）。
（注：上层胶凝好后，小心拔下梳子，用去离子水洗涤加样槽，已除去未聚合的丙烯酰胺溶液。必要时可在用带针头的注射器来扶直上层胶的齿）

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2.上样、电泳：用10μL加样枪将蛋白溶液分别加进各个泳道，20～40μg/孔，其中一泳道加入5μL的蛋白marker（可用1×loading buffer补至和旁边泳道相同体积）。接上电源，先用50-85V的低电压使样品通过浓缩胶，30min后当蛋白Marker到达分离胶后再将电压调至100-130V，直到溴酚蓝到达胶的底部（约1.5h），关电源停止电泳。
三、转膜（这里我们采用常用的湿转法）
（一）所需材料和试剂
转膜夹子（包括海绵和滤纸），转膜用的盆，PVDF膜，转膜用切胶刀，冰盒冰块，洗膜盒子，电转液，TBST或PBST，5%脱脂奶粉或5%BSA，甲醇，电转装置
5×转膜液（TransBuffer）配制：分别称取 Tris 粉末 15.1 g、甘氨酸粉末 72.1 g，先用800ml蒸馏水充分搅拌使之完全溶解，然后补加蒸馏水定容至 1 L，再次混匀充分，4℃保存；使用时按照“5×转膜液:甲醇:蒸馏水=1:1:3”比例配成 1×工作液，配好后置于4℃或者冰上预冷。
1×TBST 缓冲液（1L）：先配置10×TBS：分别称取 Tris 粉末 12.1g、NaCl 粉末 88 g，先用800 ml蒸馏水充分搅拌使之完全溶解，然后用浓盐酸调 pH 值至 pH=7.5~7.6，补加蒸馏水定容至总体积1 L，用时稀释成1×，再加1mL Tween-20再次混匀充分后保存于 4℃待用。
5% 封闭牛奶或5%BSA：称取脱脂奶粉或BSA粉末 1g 溶于约 20ml 1×TBST 缓冲液中，放在摇床上至完全溶解，现用现配。
1、卸胶板：电泳完毕后，从电泳装置上卸下玻璃板，小心撬开玻璃板，将浓缩胶切去，在凝胶底部紧靠最左边的孔的位置切下一个角，以标注凝胶的方位
2、准备6张3mm滤纸和1张PVDF膜，转膜前PVDF膜必须用甲醇浸泡5-10分钟。在托盘中加入少量转膜缓冲液，将滤纸浸泡于其中。
（敲黑板：转膜时总报错的同学看这里，PVDF膜和滤纸的大小都应与凝胶大小基本吻合，如果滤纸或PVDF膜的面积远大于凝胶，滤纸和膜多出的边缘就大有机会接触，造成电流短路而使蛋白不能从凝胶向PVDF膜转移。）
3、在倒有转膜缓冲液的托盘中按顺序制作“三明治”：（黑-）海绵1张→滤纸3张→凝胶→PVDF膜→滤纸3张→海绵1张（白+），记住口诀：黑胶白膜。以防放错，导致膜转反了。各层之间不要有气泡，必要时可用滚棒在每层滚一滚，以排除气泡。
4、将“三明治”夹紧后放进电转内槽（“三明治”夹子的黑面对着内槽的黑面，夹子的白面对着内槽的红面），再将内槽放入电转外槽中，外槽再放入冰盒，加满预冷的电转液，将整个电转外槽置于盆中盆内装满冰，以防电转时产热使蛋白降解。

右侧图片截取自 https://www.bilibili.com/video/BV1iN4y1V7Vv/?spm_id_from=333.788.recommend_more_video.2&vd_source=6b6e7163abbf561506011f864a2276ff

转膜时间和转膜电流根据蛋白分子量大小而不同，一般可用在350mA, 90min条件下转膜，蛋白越小，需要的时间越少，否则就会转过了转到滤纸上。
四、一抗孵育
1、封闭：转膜结束后将膜取出（与胶接触的一面朝上摆放），用5%脱脂奶粉封闭，室温封闭1-2h
（注：做蛋白磷酸化相关的封闭液用TBST配制，以及后续洗涤都用TBST，避免磷酸根离子对实验造成干扰，其他则可以用PBST。如果非特异性背景依然很高，可将脱脂奶粉浓度适当提高至10%）
2、孵育一抗：膜封闭结束后用1×TBST溶液洗3次，5min/次。按照抗体说明的推荐浓度稀释抗体，将膜放入稀释好的抗体溶液中，4℃摇床或旋转孵育过夜，每个实验室孵育抗体的方式都不太一样，大家根据自己情况选择即可。
（注：除了商业化抗体，当一抗为自身制备的抗体时，可按照如下比例稀释：
多克隆抗体：1：1000~1：5000
杂交瘤细胞培养上清液：1：100
带杂交瘤小鼠的腹水：1：1000~1：10000
如果抗体敏感性很差，可室温下孵育长达18小时或4℃孵育36小时。）
Day2
五、孵育二抗
1、洗膜：一抗孵育结束后将膜取出，用1×TBST溶液洗3次，10min/次
2、孵育二抗：再将膜放入封闭液稀释好的二抗溶液中，室温（RT）孵育1-2小时
（注：一抗为抗蛋白的特异性抗体，二抗为anti一抗种属的抗体。比如一抗为anti-actin的兔源IgG抗体，二抗就为HRP goat-anti rabbit IgG其他种属的抗兔抗体，并且偶联辣根过氧化物酶HRP用于后续发光，有些商业化一抗本身就带HRP，所以就不需要孵育二抗，直接可以发光显影）

3、洗膜：二抗孵育结束后将膜取出，用1×TBST溶液洗3次，10min/次
六、发光显影
配制ECL发光液（A:B=1:1），将膜取出，把发光液加在PVDF膜上孵育5分钟左右后，上机显影、拍照。
（注：一般使用的发光液A和B分别是鲁米诺和过氧化氢，在辣根过氧化物酶（HRP）的催化作用下，鲁米诺与过氧化氢反应生成一种过氧化物，过氧化物不稳定随即分解，形成一种能发光的电子激发中间体，当后者由激发态返回至基态，就会产生荧光。在发光过程中不需要消耗HRP，HRP只是起催化作用，所以只要HRP没降解失活，每次发光后，洗一洗膜是可以重复加发光液的。但HRP作为一种蛋白酶，在室温放置时间过长，是会降解的；同时在发光过程中有什么物质污染了膜的话,也有可能灭活膜上的HRP。）
六、结果分析
Western blot结果的半定量分析可以利用灰度分析和光密度分析法。
目的蛋白灰度（或光密度）值=目的蛋白灰度（或光密度）/内参蛋白灰度（或光密度）
（注：灰度值或光密度值只是一个相对值，不同组间的灰度值对比，反映的是不同组间目的蛋白的变化趋势，并不是绝对定量值。常用的分析软件为Image J和Photoshop）

A.Trx蛋白表达水平；B.Image J分析数据；C.结果成图

使用Image J软件对Western blot结果进行分析：
如上图，需分别分析出1～4泳道Trx蛋白的条带灰度值和5～8泳道β-actin蛋白的条带灰度值，然后计算图B中1～4泳道的intDen值分别比上5～8泳道的intDen值，即得每个样本的Trx/β-actin灰度值，最后将各个样本计算出来的Trx/β-actin灰度值进行归一化处理然后作出柱状图，即得图C的Western blot半定量柱状图。
好了，就讲到这里，后面我们来聊聊磷酸化抗体检测以及为什么有些同学的WB图不尽人意，如何规避，以及内参选择的一些门道。
别忘了点赞、转发、关注，我是老熊，下一篇推文见！
Western blot 实验进阶版之磷酸化蛋白检测那点事儿
总概篇：真核表达系统（第一弹）——酵母表达系统
单细胞数据库挖掘系列课程（一）：一文了解单细胞RNA测序原理
一文：顺水推舟——如何靶向细胞衰老消灭肿瘤

清风寡欲 · 发表于 2025-3-3 13:13

Western blot，中文为蛋白质免疫印迹试验，简单来说是抗原抗体特异性结合。
电泳分离后的蛋白转移到固相载体PVDF膜上，以共价键的形式吸附蛋白质，并作为抗原结合特异性抗体。二抗作为显色标记，经过底物显色反应组织和细胞中蛋白的表达情况。

蛋白提取

组织蛋白提取
相对于细胞而言，组织蛋白的提取对技术和外界环境要求会更高一些。因为我们养的细胞很多是根据具体实验选择的特定细胞，而组织大多是为了丰富体内实验的各种蛋白的混合体，目的蛋白的含量并不一定充分，而且其中还包含着丰富的蛋白酶、血液或者脂肪等干扰因素。
所以个人认为，提取组织蛋白一定要做预实验，这是很有必要的。可以摸清楚每次应该取多少重量的组织，什么样的离心条件可以去除血液和脂肪的干扰。比如像心脏、脾这类血液较多的组织，剪成米粒大小的小块儿后，加入适量PBS(PBS:PMSF=100:1，PMSF为苯甲基磺酰氟，蛋白酶抑制剂，30min内会降解一半，因此每次提取蛋白要加新鲜的PMSF)，7500g离心力，离心5分钟，去上清。如果感觉血液还是很多，可以重复上述步骤数次。
蛋白提取的全程要在低温环境下进行，以防止蛋白降解。30mg的组织对应500ul的RIPA裂解液（RIPA全称为Radio Immunoprecipitation Assay，RIPA:PMSF=100:1），置于冰上，使用研磨棒或电动组织研磨器充分研磨30分钟，再置于冰上静止30分钟。
在12000rpm转速下，4度离心15分钟，取上清，测蛋白浓度。
2.细胞蛋白提取
细胞蛋白的提取相对来说耗时会少很多，只是在贴壁细胞和悬浮细胞的处理方式上略有不同。
对于贴壁细胞而言，去除培养基后，用无菌预冷的PBS清洗3次，每次3分钟。对于像6cm的培养皿，我习惯每次加100ul的RIPA裂解液（RIPA:PMSF=100:1），转动培养皿，让裂解液接触到整个皿面。之后用细胞刮刀将皿里的细胞刮刀一侧，冰上静置15分钟后，在12000rpm转速下，4度离心15分钟，取上清，测蛋白浓度。
对于悬浮细胞而言，吸出培养皿中的培养基，按照传代时离心力大小和时间进行离心。离心结束后，小心的倒掉上清，加入100ul的RIPA裂解液（RIPA:PMSF=100:1），冰上静置15分钟后，在12000rpm转速下，4度离心15分钟，取上清，测蛋白浓度。
3.测定蛋白浓度
蛋白浓度的测定一般选用BCA工作液（bicinchoninic acid），BCA工作液作为一种稳定的水溶性复合物，可以与二价铜离子结合，产生紫色复合物。562nm波长条件下测定吸光度，制作标准曲线，吸光度与蛋白浓度成正比。
4.蛋白变性
根据蛋白的体积，计算加入多少体积的1*loading buffer，煮沸5分钟即可。Loading buffer中主要含有溴酚蓝、二甲苯氰和甘油。前两者起到指示作用，甘油起到沉降蛋白的作用，以防加样时蛋白飘出。
电泳
1.制胶
根据目的蛋白的分子量大小选择不同浓度的分离胶，8%、12%和15%三种浓度的分离胶就完全可以搞定日常蛋白的测定。一般测定100kDa分子量以上的蛋白可选择8%浓度的分离胶；测定20kDa分子量以下的蛋白可选择15%浓度的分离胶，中间的分子量可选用12%浓度的分离胶。
有的时候蛋白跑不出来，其实未必是分离胶浓度选的不好，也有可能是marker的问题。marker起到的是蛋白分子量指示剂作用，但是要根据蛋白分子量选择合适的marker。一般的marker分子量范围在10-130kDa之间，都可以满足正常蛋白的需要。
但有些分子量范围较广的marker，比如说6-250kDa，虽然说它范围很广，可中间的蛋白分子量并没有区分的很细，只适用于大分子或小分子蛋白，而对于30-70 kDa的蛋白并不是很适用。

电泳条件

个人使用的条件一直是80V，300mA跑浓缩胶，120V，300mA跑分离胶，恒压电泳。当然了，这个电泳条件不是固定的，也有人选择恒流跑电泳。个人认为恒流和恒压对电泳的效果影响没有什么区别。因为配胶的成分中SDS起到的作用是破坏蛋白质分子和其它物质分子之间的非共价键。
解聚后的蛋白质分子与SDS形成的复合物带有负电荷，远远超过蛋白质本身的电荷量，所以就不存在不同蛋白质分子之间的电荷量不同造成的影响了，恒压或恒流都只是起到推动作用。
至于浓缩胶和分离胶的条件不同，我想这一点大家应该都很清楚了。浓缩胶中的孔隙较大，起到的作用是为了让蛋白质混合物在进入分离胶之前都到达同一起跑线，以便在分离胶中更好的分开，因此一定要充分跑完浓缩胶之后再调电压。
转膜

转膜分为湿转和干转。湿转就是把三明治结构放在转膜液中进行；干转，其实应该是半干转，虽然不放在转膜液中进行，但是滤纸也要事先泡过转膜液。有人说，湿转主要用大分子蛋白质转膜，半干转主要用于小分子蛋白质转膜，但是个人认为湿转就完全可以搞定大小所有分子量的蛋白，而且从转膜稳定率来说要好于半干转。
所以个人习惯于用湿转。一般情况下的转膜条件是220V，300mA，转膜时间是1小时20分钟。对于10-180kDa分子量的蛋白，这个条件是完全可以的。虽然网上有很多人说小分子量的蛋白需要缩短转膜时间，或者改变电压电流，但是本人试过用这个条件转8kDa的蛋白质，一样没有问题。相反的，我缩短了转膜时间，或者改成了100V，300mA的转膜条件，转膜的效果反而不好。
所以个人认为，转膜效果的好坏除了要考虑机器本身设定的条件外，还需要考虑一下其他因素。有很多新手用完转膜液忘记放回4度冰箱，时间久了，转膜液的离子成分就会发生改变，影响转膜效果；或者是滤纸使用太久了，也会影响转膜效果；又或者是要研究的蛋白自身性质决定的。Western blot并不适用于所有的蛋白，对于检测一些分泌型的蛋白，ELISA会更适合，所以也并不是说蛋白实验一定要用Western blot。
发光

选用ECL发光液发光。ECL发光液分为A液和B液，按照1:1的条件混合配制。洗膜结束后，倒出多余的TBST，但是也要在洗膜的塑料盘中留有一些，防止PVDF膜干掉。基本上1ml的工作液可以覆盖10cm3，发光的效果与发光液的新鲜程度有关，所以要现用现配。
ECL的发光原理是：发光剂中的鲁米诺被过氧化氢和HRP氧化，产生荧光，整个发光过程被增强剂增强了发光效果，可以将灵敏度提高到1000-100000倍，但是也会遇到猝灭的情况，除了成像机器老化的原因外，也与发光液的新鲜程度和一抗二抗的浓度有关。
质量好的发光液配合着合适的一抗二抗浓度，才能快速完美的发光。小于1分钟的发光时间固然是我们所向往的，但是碰上信号低的蛋白，我们也要想尽办法让它们显示出结果。对于信号弱的蛋白条带，我们可以手动调整发光时间少一些，比如说10sec，快速曝光比延长曝光时间的显影效果更好。
用各种软件处理分析蛋白条带

1.Photoshop CS6

PS软件在后期投稿整理图片方面会有很大作用，这里我想说的是利用PS改变条带的对比度，减少后续利用Image j对蛋白灰度值进行测定时的干扰。
正常机器发光之后的图片，背景都会泛蓝，我们可以选择PS软件中，图像-调整-去色，把条带背景统一调成灰色后再测灰度值。
2.ImageJ
利用Image j测量蛋白灰度值的方法，我想大家都很熟悉了，我就不详细的列出每一步了。
这里想提到一点，BCA测出的蛋白浓度有时会存在一定的误差。我们在测蛋白标准曲线时，得出的R值肯定是9越多越准确，但是实验过程中，我们往往只有一或两个9，导致内参发出来的效果也是各组略有差异。为了追求完美，我们可以通过内参的灰度值进行作比，以一个组的蛋白浓度为定量，适当调整其他各组上样量即可。
如果初入实验室时，能够接手师兄师姐的实验，顺带用用师兄师姐传下来的protocol就很幸运了。那要是很惨的被放养，自己摸索protocol，可就要走一步看一步了，毕竟网上五花八门的protocol，信息参差不齐，步步是坑，这要是没有一份靠谱protocol傍身，迟早要脚下一黑的。
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