25考研丨细胞生物学研究方法（上）丨持续更新细胞生物学知识一轮复习

二维码

细胞生物学研究方法




01
分辨率的概念

分辨率（resolution）
【定义】指的是能够区分开两个质点间的最小距离，是显微镜最重要的性能参数。
【特点】缩写是D，D的高低取决于光源波长λ，物镜镜口角α和介质折射率N。



光学显微镜的最大分辨率：当α最大值取140°，最短的可见波长λ=450nm，介质折射率N在油镜下为1.5时，此时普通光镜的分辨能力的极限为0.2um，此数值为显微水平和亚显微水平的分界点。



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02
光学显微镜的类型、原理、特点、应用

1.普通复式光学显微镜%28light microscope%29
【定义】是能够将细胞的超微结构展现在人们面前的研究细胞生物学的重要工具。
【特点】分辨率高达0.2um。
【结构】①光学放大系统， 为两组玻璃透镜:目镜与物镜。②照明系统:包括光源和聚光镜，有时另加各种滤光片以控制光的波长范围。③镜架及样品调节系统。
【意义】在研究细胞的结构与功能，特别是生物大分子在活细胞中的定位及其动态变化和相互作用展示出了新的活力。
【应用】可以直接用于观察单细胞生物或体外培养的细胞。
观察生物组织样品，采用石蜡制片法，其步骤为：取材、固定、脱水、包埋、切片、脱蜡、复水、染色、脱水、透明、封片、观察。其中固定的目的是使用固定剂杀死细胞，并使细胞结构尽可能接近活细胞。脱水使用乙醇，包埋使用石蜡，切片使用切片机，脱蜡、染色采用多种染料，封片来长期保存。
苏木精和伊红染色（H-E染色）：如苏木精和伊红染色%28又称H-E染色%29就是一种常用的染色方法。碱性染料苏木精和酸性染料伊红分别与细胞核和细胞质的某些成分特异性地结合，从而改变透射光线的波长，我们就可以清晰观察到蓝紫色的细胞核和红色的细胞质的形态。

2.相差显微镜%28phase-contrast microscope%29
【定义】是一种可以用于观察未染色标本的显微镜。
【原理】是在普通光学显微镜的基础上，添加两个元件，即“环状光阑”和在物镜后焦面上的“相差板”，从而可将这种光程差或相位差，通过光的干涉作用，转换成振幅差，因此，可以分辨出细胞中密度不同的各个区域。
【应用】利用增强样品的反差实现对非染色活细胞的观察。



3.微分干涉显微镜（differential-interference microscope%29
【定义】是一种在相差显微镜基础上以平面偏振光作为光源的一种显微镜。
【原理】使样品中厚度上的微小区别转化为明暗区别，能显示结构的三维立体投影影像。
【特点】其标本可略厚一点，折射率差别更大，故立体感更强。
【应用】比相差显微镜更适合用于活细胞研究，分辨率比普通光镜提高了一个数量级，接上高分辨率录像装置时，可以用来观察活细胞中的颗粒及细胞器的运动，如物质沿着微管运输的动态过程。

4.荧光显微镜%28fluorescence microscope%29
【定义】在光镜水平上，对细胞内特异的蛋白质、核酸、糖类、脂质以及某些离子等组分进行定性定位研究的有力工具。
【特点】采用的光源和光学系统均与普通光学显微镜有所不同，其核心部件是滤光片系统以及专用的物镜镜头。
【原理】通过激发滤光片的短波长的激发光，照射标记在样品中的荧光分子上，使之产生一定波长的可见光即荧光。
（1）样品制备
①免疫荧光技术（将荧光分子与抗体偶联）：直接免疫荧光（一抗）、间接免疫荧光（二抗）；
②荧光素直接标记技术：常用的直接标记技术如，荧光染料DAPI特异性地直接与细胞中的DNA相结合，从而显示出细胞核或染色体在细胞中的定位；（DAPI：与DNA中大部分A和T相结合的荧光染料，当UV照射发出蓝色荧光，可透过细胞膜，用于活细胞、固定细胞染色，还可用于观察凋亡时细胞核、染色体的形态变化）
③绿色荧光蛋白（GFP）的基因与编码某中蛋白质的基因相融合表达
5.激光扫描共焦显微镜（laser scanning confocal microscope，LSCM）
【定义】相当于在荧光显微镜基础上安装了一套激光共焦成像系统的显微镜。
【原理】以激光为光源，聚光镜和物镜同时聚焦到同一点上，排除焦平面以外地成像，利用激光扫描装置和计算机高速采集与处理汇聚每一个点上的信息，形成清晰的二维图像。
【特点】分辨率比普通荧光显微镜高1.4-1.7倍
【应用】亚细胞结构与组成的定位及动态变化等方面

6.超高分辨率显微术
（1）全内反射荧光显微术%28 total internal reflection fluorescence microscopy, TIRFM%29
【定义】是基于斯涅耳定律的一种超高分辨率显微术
【原理】即当光线从光密介质进入光疏介质时，一部分光会发生折射，而另一部分光线会发生反射并且，当入射角%280%29的角度增大时，折射角%2802%29也随之增大。当入射角达到临界角%280c%29 时，折射角的角度达到90%。当入射角继续增大时，就会发生全内反射%28TIR%29 现象。此时，光线会在介质的另一面产生隐失波。隐失波的能量范围通常在200nm以内，且在z轴上呈现指数衰减，因此可以激发很薄一层%28约100 nm%29样品内特定的荧光分子发光，这样就大大降低了背景噪声的干扰，提高了图像分辨率。
【特点】只能观察细胞紧靠玻片的大约100 nm的范围
【应用】观察细胞质膜以及紧靠细胞质膜的细胞骨架组分的动态行为
（2）基于单分子成像技术的PALM/STORM方法
①光激活定位显微术%28photoactivated localization microscopy, PALM%29
【原理】将目的蛋白克隆到PA-GFP表达载体，并转染细胞。待融合蛋白表达后用较低能量的405nm激光照射细胞，随机地使很少一部分%28 相隔较远的%29 PA-GFP激活，再用488nm激光激发激活的PA-GFP发出绿色荧光，通过高斯函数拟合将这些荧光分子定位，然后用488nm激光将这些已经精确定位的荧光分子漂白，使其不能在下一轮激光照射时被激活。重复上述过程，每次都用405 nm和488 nm激光来激活、激发、定位和漂白少量的荧光分子，如此持续进行数百个循环，直到将细胞内几乎所有的荧光分子都精确地定位，并将所得到的图像合成在一张图上。
【特点】分辨率比传统的光学显微技术高10倍以上
【应用】只能用于观察外源表达蛋白的定位，并且每一幅图像照相所需的时间很长，不适合用于活细胞动态观察
②随机光学重构显微术%28stochastic optical reconstruction microscopy, STORM%29
【原理】基于花青染料可以被一种波长的光激活发出荧光，还可以被另一种波长的光波关闭而处于暗态，可以用不同波长的光波照射这些花青染料以控制它们发光或不发光。这样，就可以将原本靠得很紧的蛋白质用成对的染料%28如Cy3/Cy5%29标记的特异抗体反应，在显微镜下先用激光使报告分子Cy5失活，然后用561 nm激光随机地激活少数几个Cy3，并导致其配对的Cy5活化，再用647nm激光激发Cy5，使其发出670nm的荧光，信号被相机捕捉后通过高斯拟合求出其中心位置。重复上述过程10 000次以上，以得到100万个以上的数据，就可以重构出内源蛋白分布的高分辨率图像
【特点】得到一张超分辨图像的时间很长，在活细胞中很难实现
【应用】细胞内源性蛋白的超分辨率定位的方法，采用不同的荧光染料对，应用STORM可以对多达4种内源性蛋白进行精细定位，分辨率可以达到20 nm左右
（3）4π和STED显微术
①4π显微镜
【原理】基于增加物镜的接受角而等效增加物镜的数值孔径%28NA%29。具体是在样品的两侧各放置一个相同的高性能物镜，使总的接受角接近4π，进而提高了NA
【特点】成功地将z轴分辨率从500nm提高到100nm左右，但4π显微镜并没有突破衍射极限
②受激发射损耗%28stimulated emission depletion, STED%29显微术
【原理】使用一束激光，仅仅激发一个点的荧光基团并使其发出荧光，然后再用第二束象面包圈那样的环状高强度的脉冲激光照射那个点周围的荧光，该激光的波长可以使发光物质从受激状态返回到基态。这样，就只有中间没有完全损耗的荧光分子可以观察到。环状激光中间的孔径越小，图像的分辨率就越高。
【特点】STED显微术的分辨率不受光的衍射过程所限制，利用该技术可以使水平面的分辨率达到纳米级，而且可以快速地观察活细胞内的实时动态变化，如记录神经元突触小泡的行为，但没有提高z轴方向的分辨率。如果将4π和STED结合，将可以同时提高z轴方向的分辨率。
%284%29结构照明显微术%28structured-illumination microscopy, SIM%29
【定义】将非线性结构照明部件引入到传统的显微镜上，使显微镜的硬件系统增加了光栅和控制元件，软件系统可对所获取的图像信息进行计算的一种显微术
【原理】是通过光栅的旋转和移动将多重相互衍射的光束照射到样本上，并在此发生干涉，然后从收集到的发射光模式中提取高分辨信息，生成一幅完整的图像。
【特点】利用结构照明术可使x、y平面分辨率达到100 nm, z轴向分辨率也提高了2倍。其优点是对于普通的免疫荧光标记样本和各种荧光蛋白表达样本，可以不经特殊处理直接观察。其缺点是分辨率远低于其他超高分辨率显微术
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03
电子显微镜

1.电子显微镜基本知识
电子显微镜（electron microscope，EM）
【特点】分辨率更高，图像需要通过荧光屏、感光胶片或电荷耦合器件进行显示和记录
2.电子显微镜构造
电子束照明系统：包括电子枪和聚光镜。由高频电流加热钨丝发出电子，通过高电压的阳极使电子加速，射出电子经聚光镜汇聚成电子束。
成像系统：包括物镜、中间镜、投影镜等，它们是经过精密加工的中空圆柱体，里面装置线圈，通过改变线圈的电流大小，调节圆柱体内空间的磁场强度。电子束经过磁场时发生螺旋式运动，最终的结果如同光线通过玻璃透镜时一样，聚焦成像。
真空系统：用两级真空泵不断抽气，保持电子枪、镜筒及记录系统内的高度真空，以利于电子的运动。
记录系统：电子成像须通过荧光屏显示用于观察，或用感光胶片或CCD相机记录下来。
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04
电子显微镜与光学显微镜的区别

【分辨本领】光学显微镜：200nm；电子显微镜：0.2nm

【光源】光学显微镜：可见光；电子显微镜：电子束
【透镜】光学显微镜：玻璃透镜；电子显微镜：电磁透镜
【真空】光学显微镜：不要求真空；电子显微镜：要求真空
【成像原理】
光学显微镜：利用样本对光的吸收形成明暗反差和颜色变化；
电子显微镜：利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差
【基本构造】
光学显微镜：光学放大系统（目镜与物镜）、照明系统（光源和聚光镜）、镜架及调节系统；
电子显微镜：电子束照明系统（电子枪和聚光镜）、成像系统（物镜、中间镜与投影镜）、真空系统、记录系统（荧光屏或感光胶片或CCD）
【标本制备方式】
光学显微镜：光镜观察的标本一般置于载玻片上，如普通组织切片标本、细胞涂片标本等
电子显微镜：电镜观察所用的组织细胞标本制备程序复杂，技术难度和费用都较高，在取材、固定、脱水、和包埋等环节上需要特殊的试剂和操作，最后还需将包埋好的组织块放入超薄切片机切成50-100nm厚的超薄标本片
【能否能观察活细胞】
光学显微镜：能
电子显微镜：不能



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05
电镜制样技术
1.超薄切片技术
（1）概念
超薄切片技术（ultrathin section）
【定义】由于电子束的穿透能力有限，为获得较高分辨率，切片厚度一般仅为40~50 nm，即一个直径为20μm的细胞可切成几百片，故称超薄切片
【步骤】固定、包埋、染色、切片
【特点】需要样品既要有一定刚性又要有一定韧性，而生物样品并不具备这些特性，为此，样品往往需要包埋在特殊的介质中。但包埋的过程会破坏样品的细微结构，所以超薄切片样品制备的第一步就是样品的固定，以期更好地保存细胞的精细结构。
【应用】可以观察各种细胞的超微结构
（2）详细步骤
①固定：固定是保持样品的真实性的一个最重要的环节。固定不仅要求保持样品的形态和精细结构不发生改变;有时还要求细胞内部的成分保持在原来的位置上，甚至其免疫原性尽可能的不发生改变。在固定操作过程中，动物的处死和取材都要快速进行，以防细胞自溶作用造成的损伤。
②包埋：包埋的目的是保证在切片过程中，包埋介质能均匀良好地支撑样品，以便获得连续、完整并有足够强度的超薄切片。生物样品固定后含有大量水分，而包埋剂多具疏水性质。因此固定的样品在包埋前通常要经过一系列的脱水处理。
③切片:切片厚度通常是40~50nm。切片厚度可通过样品杆的金属热膨胀或机械伸缩来控制。切片须捞在覆有支持膜%28如Formvar膜%29的载网%28 铜网或镍网，一般直径3 nm%29上，用于染色和电镜观察。
④染色：电镜样品用重金属盐进行染色，不同成分对各种重金属盐的亲和力不同，电子束穿过样品时，样品中的金属离子不同程度的散射和吸收电子，在样品的图像上形成明暗差别，是电镜下观察图像为黑白色的原因。



2.负染色技术（negative staining）
【原理】用重金属盐%28如磷钨酸钠、醋酸双氧铀等%29对铺展在载网上的样品进行染色，使整个载网都铺上一层重金属盐，而有凸出颗粒的地方则没有染料沉积。由于电子密度高的重金属盐包埋了样品中低电子密度的背景，增强了背景散射电子的能力以提高反差，这样，在图像中背景是黑暗的，而未被包埋的样品颗粒则透明光亮，这种染色称为负染技术。
【特点】负染色是只染背景而不染样品与光学显微镜样品的染色正好相反，分辨率可达1.5nm左右
【应用】经纯化的细胞组分或结构可以通过这个技术来显示精细结构

3.冷冻蚀刻技术
（1）概念
冷冻蚀刻技术（freeze etching）
【定义】是在冰冻断裂技术的基础上发展起来的更复杂的复型技术
【步骤】样品制备过程包括冷冻断裂和蚀刻复型两步
【应用】主要用来观察膜断裂面上的蛋白质颗粒和膜表面形貌特征
【特点】图像富有立体感，样品不需包埋也不需固定，能更好的保持样品的真实结构。
（2）详细步骤
①用快速低温冷冻法，在液氮或液氦中将样品迅速冷冻，然后在低温下进行断裂（此时冷冻样品往往从结构相对“脆弱”的部位裂开，从而显示镶嵌在膜脂中的蛋白质颗粒）
②经过一段时间冰的升华，进一步增强图像“浮雕”样的效果
③用铂等重金属进行倾斜喷镀，以形成对应于凹凸断裂面地电子反差
④用碳进行垂直喷镀，在断裂面上形成一层连续的碳膜
⑤用消化液把生物样品消化掉→将复型膜（碳膜及其被碳膜包裹的，含有图像信息的金属微粒膜）移到载网上→在电镜下进行观察
%283%29快速冷冻深度蚀刻技术（quick freeze etching）
【定义】在冷冻蚀刻技术的基础上发展出来的技术
【应用】用于观察细胞质中的细胞骨架纤维及其结合蛋白

4.电镜三维重构与低温电镜技术
（1）电镜三维重构技术（electron microscope three-dimentional reconstruction technique）
【定义】电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的具有重要应用前景的一门新技术。
【意义】电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学，主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段
【应用】适用于分析难以形成三维晶体地膜蛋白以及病毒和蛋白质-核酸复合物等大的复合体的三维结构

%282%29低温电镜技术%28cryo-electron microscopy%29
【原理】低温电镜技术制备的生物样品，一般不经过固定、包埋、染色和干燥等步骤，而是将样品直接在冷冻剂中快速冷冻，形成100~ 300 nm厚的冰膜，在电镜内-160C低温下利用相位衬度成像。获得的大量图像还要经过一系列数据处理后，构建出样品的三维结构密度图。
低温电镜单颗粒分析技术%28single particle analysis%29
【定义】研究生物大分子的三维结构的一种技术
【特点】目前最主要的也是发展最快的电镜三维重构方法，其三维结构图像已接近原子尺度的分辨率，为解析生命活动运转中的各种“纳米机器”的结构与作用机理，提供了重要的实验手段。

%283%29电子断层成像技术%28electrontomography%29
【定义】利用电镜图像进行三维重构的重要技术
【原理】它是对样品中同一物体，在不同的倾角下连续拍照，获得一系列二维投影图片，再重构其三维结构。
【应用】研究蛋白质复合体的三维结构，但其分辨率明显低于低温电镜单颗粒分析技术。然而这一技术还可用于更大尺度的细胞器、细胞骨架、膜泡运输系统等三维结构的研究

%284%29扫描电镜背散射电子成像%28back scattered electron imaging%29
【定义】可以研究细胞、组织等更大尺度的超微结构的三维结构，这在揭示神经元之间的相互关系的脑科学研究中，是一项不可或缺的重要技术。
【原理】扫描电镜背散射电子图像携带了原子序数的信息，因此，对所观察的组织块染色后，可以显示出如同超薄切片样品的细胞内部结构。在扫描电镜中，做类似超薄切片的处理，同时利用其背散射电子成像，就可以得到一幅幅样品内部的超微结构图像，进而构建成整个组织的三维结构图象。

5.扫描电镜技术（scanning electron microscope，SEM）
【定义】一种重要的显微镜观察技术
【原理】为利用电子束逐点扫描样品表面，通过检测样品表面散发的二次电子、背散射电子等。二次电子由探测器收集并被闪烁器转变成光信号，其产生多少与样品表面的形貌相关。通过扫描电镜可以得到样品表面的立体图像信息。
【特点】景深长，成像具有强烈的立体感，一般扫描电镜的分辨本领仅为3nm
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06
扫描隧道显微镜

扫描隧道显微镜（scanning tunnel microscope，STM）

【定义】利用量子隧道效应产生隧道电流的原理制作的显微镜
【结构】包括实现x、y、z三个方向扫描的压电陶瓷，逼近装置，电子学反馈控制系统和数据采集、处理、显示系统
【应用】在生物学中，可观察大分子和生物膜的分子结构。
【特点】①具有原子尺度的高分辨本领；②真空、大气、液体环境中都能工作；③非破坏性测量，保持样品原貌，基本可以避免样品发生形变
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