第四代测序（纳米孔测序）有望全面代替边合成边测序吗？

风云

第四代测序（纳米孔测序）有望全面代替边合成边测序吗？
原文地址：https://www.zhihu.com/question/26491456

长长的路

这两年纳米孔测序技术发展的如火如荼，老题新答一下~
仅考虑生物纳米孔技术（固态纳米孔还没有成功商业化）的话，我们可以把全面替代，分成技术应用上的全面替代和市场上的全面替代。
技术应用方面，主要是功能和性能。功能方面，目前纳米孔测序已经超越了边合成边测序（SBS）能做到的范围，纳米孔测序技术除了支持DNA单分子测序，也支持RNA直接测序，同时可检测碱基修饰的信息，另外短片段与长片段均可测序（ONT已可以支持最短20bp以上的片段测序，最长目前做到的大于4M）。除了常规DNA/RNA，目前已有科研文章基于纳米孔技术实现了蛋白测序，比如2021年一篇science文章，来自代尔夫特理工大学的科学家，基于MspA纳米孔，通过对一条肽链反复读取，获得了单个氨基酸错误率小于10的6次方的肽链鉴定结果。国内也有清华大学白净卫老师课题组（国产纳米孔测序公司齐碳科技创始人），以及南京大学黄硕老师课题组，实现了蛋白测序的功能。现在多组学的概念至少在科研方向是很深入的，未来也可能成熟的转化到临床以更精准的实现临床目的，所以纳米孔一次测序获得多个组学的信息的功能，只要性能达标，不管是在科研还是临床，理论上都是更有优势的（也有样本直接扔进去，获得基因组、转录组、碱基修饰、蛋白组全部信息的想象空间~）。性能方面，其实也包括可接受的样本量起始、测序时间、测序准确性等等，但是大家首先关注的一般还是准确性，不幸的是在目前为止，纳米孔在准确性方面还是大家拉踩的主要点，虽然raw reads质量已经达到部分Q20，但确实难以在很短时间内全面追平或者超过SBS。如果性能这关过不去，将极大影响纳米孔测序技术在临床方向的应用范围。不过个人觉得要不了十年纳米孔测序在准确性上是可以达到与SBS技术同等水平，或者说同等可用的水平的。综上，在技术应用方面，十年左右的时间，个人觉得纳米孔测序技术是很有可能做到全面替代SBS技术的，即能用SBS做到的事情，用纳米孔测序也都可以，甚至超越SBS能做到的范围。
市场方面，个人觉得十年内都不可能全面替代SBS产品，抢占份额是肯定的，但毕竟技术性能短期还没有达到可全面替代，而且二代测序依然是市场主力，老牌大厂在积极稳固自己的地位的同时，新生力量也在主动发力突破。比如illumina已经通告了infinity技术，预期生成长达10k的reads，可极大程度弥补其测序片段短的短板，并且计划于2022年下半年开放先期体验（https://mp.weixin.qq.com/s/ML-ZrPx3bWaLUwgXCusglg）；比如Element Bio这种新生技术公司重构SBS技术，推出高准确性、测序时间更可控、成本更低的新产品AVITI，raw reads的质量甚至可以做到80%大于Q40。所以各个厂家都会积极应对未来的风险，探索增长的路线，他们的决策以及研发产出，都会影响未来各家的走向，谁想要在市场上完全替代谁，都是非常困难的。不过基于上述提到的技术潜力，以及测序原理及配合测序原理而设计的检测设备原理来看，长期的话，从功能、性能、价格潜力等几个主要的因素考虑，纳米孔技术相对有更好的想象空间。
然后，以上观点的来源主要是基于公开材料和个人对主流测序平台目前信息的了解，整理了下主要参数放到了下面的表格。在对比同样参数时，标红了个人评价更有优势的平台的信息，可以看到以ONT为代表的纳米孔测序技术在更多的方向有优势（国内有齐碳科技在做纳米孔测序仪，已经发布了他们的测序仪产品，我们也可以期待下国产能力），当然每个参数在不同应用方向获得的权重会不一样，有兴趣的也可以尝试下利用自己心中的权重进行评分看下这几种技术，哪种最具优势和潜力。


*声明：本文只代表本人个人观点，本人与表格中所提及的公司均无利益往来。如有不准确的地方，欢迎补充或指正，以及一起探讨。

同花顺

短期内，干的活不一样，互相不能替代。

• Nanopore Sequencing测得长，但是错误率也高。错误率高可以慢慢降低，但是有一个问题是短时间内解决不了的，就是建库的时候，如果建库长度长，那么定量就会有很大bias。所以，所谓4代测序，现在定性目标是可以达到的，定量还差一些。
  
• 二代测序定量一般很准，当然也有很多bias，但是有一套成熟的流程支撑。
  

长期来看，
如果建库，测序，分析整个水平都提升上来，价格再降下去的话，二代市场会挤压很多。但可能都是5到10年以后的事情了。

开个脑洞，
最理想的状态下，是1个活体细胞，扔到Nanopore里面，里面所有的DNA，RNA，蛋白质全部定量，全部测序出来。

以上。

感恩由您

更新
Nat Biotech 发表的纳米孔测序完成人类基因组组装的新成果有哪些突破？该技术还有哪些优化空间？#########
实验室有几个纳米孔,也做了很多测试,确实相对于二代的仪器来说,测序结果很糟糕,往往不能作为标准性的数据。
优点在于测序速度很快,而且可以做实时的分析,一边测序一边分析结果就可以处理出来。但准确度无法和二代相比,误差很大。
不过牛津一直在更新芯片和技术,准确度的问题也一直在变好。我比较相信还是有很大的发展空间。
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更新最近进展
首先,纳米孔的测序精度已经有大幅提高,从大概80%提高到98%左右,虽然和二代相比还是有差距,但是可以通过后续的分析进行改进,现在已有很多算法通过对比read之间的差异,对read进行矫正,提高测序精度,可以达到99.5%,现在广泛的做法,就是结合二代和纳米孔技术,整体提高测序能力
其次,纳米孔长read相较illumia的短read来说,其作用大很多,可以用来检测基因组的重复区域,以及肿瘤基因组的复杂重组问题,而且对于基因组拼接也有很大帮助
另外,现在纳米孔可以用于RNA测序,能够直接测序出完整的转录本,这是二代无法比拟的
最后,MinION太便携了,口袋里一放,就带走了,非洲埃博拉肆虐的时候,伯明翰的Nick Loman直接带着它去非洲测序分析,大大降低了时间成本

长长的路

下个月10号PacBio来我们学校做报告兼演示，可能还有上机，回来了向大家报告。由于我自己不是做基因组的，有错误的地方请大家指正。
12/10/2014
听完报告回来了。这个是这次报告的链接
PacBio Workshop, December 10, 2014第一位是PacBio的科学家，他们的技术称做Single Molecular in Real Time(SMRT)，几个要点

• 不需要PCR，直接测序单个DNA分子
  
• 读长很长，在10kb级别甚至更高
  
• Contig的数量大幅下降（可以到只有一个），小型基因组可以做到封闭（这个有什么术语吗？）。
  
• 测序速度快，1-4小时
  

第二位是南边MayoClinic的科学家，现在明大的样品是送到那里去测

• 他提高了价格，大概是$342/Cell，这里的Cell就是SMRT Cell，相当于illumina的lane.
  
• 明大的样品要Fedex过去。
  
• 机器好大。。。
  

第三位是明大Super Computere Institute（MSI）的。主要介绍了MSI提供的分析工具，基本上半自动了。这部分这周五有上机，回来我再补充。
不知道谁提到了一点，虽然illumina的读长短，但准确度略高于SMRT。所以也有人讲SMRT和illumina测序结合起来组装基因组。
之后的几位都是明大的教授了，大家基本上都是说SMRT在自己研究领域的作用。超长的读长可以显著降低基因组组装时的不确定性，应该是未来的方向。但目前SMRT的通量还不高，一个Cell只能够组装微生物的基因组，但是PacBio也在实验新的试剂，可以提高通量。
大致就是这样了哈。过两天MSI会把PPT贴出来，大家想看我就传上来哈。
回到问题上，我觉的目前PacBio已经可以替代小型基因组的测序了，至少可以配合illumina一起使用。但是像我这样做amplicon测序的，还是illumina MiSeq更合适。

队长是我

考量一种测序技术主要有以下几个参数：通量，读长，准确度，单位成本。而单位成本一般可以简单认为和通量成反比，所以简单点就直接考虑前三个因素就行了。
其中读长和准确度都是越长越准确越好，但通量就要看情况了，Sanger测序之所以还在用，一方面是其读长较NGS长，准确度好，另一方面也是因为其通量低，操作简单快速成本低，这使得Sanger测序在某些应用上有其特有的优势，试想某个研究项目中我只想知道某个300bp的外显子的序列，难道还非得用NGS去测吗？当然如果有一天NGS发展到测完整个exome的成本、时间、准确度都比Sanger测一个外显子还有优势的时候，估计Sanger测序也就没人用了。
纳米孔测序也同理，包括PacBio的单分子测序（还有Helicos，不过貌似破产了），这些单分子测序目前最大的优势是读长很长（Helicos除外，难怪破产orz），但通病是通量低、准确度低（注意这几个平台的测序错误与NGS的不太一样，其测序错误都是随机的，也就是说理论上可以通过循环多测几次来矫正，所以准确度低从根本上来说是通量低）。从这个角度看，如果单分子测序的通量能够跟上NGS，那全面取代NGS是早晚的事；如果不行，那只会在某些需要通量不高的应用中逐渐取代NGS，而对于诸如肿瘤这种需要极高通量的somatic测序项目要取代NGS则不太可能（除非通量跟上去）。