分子生物学 | DNA复制的酶学

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课程：分子生物学
主题：DNA复制的酶学
1 E.coli的三种DNA聚合酶

1.1 DNA聚合酶Ⅰ

E.coli DNA聚合酶Ⅰ(DNA polymerase Ⅰ)由一条分子质量102kDa的多肽链组成，具有三种不同的功能：

• DNA聚合酶活性；
  
• 3'→5'核酸外切酶(Exonuclease)活性：用于向后去除错配的核苷酸，对新合成DNA进行校正(proofreading)。
  
• 5'→3'核酸外切酶活性：降解聚合酶前方的DNA链，切除受损或错配的DNA序列，或切除RNA引物。
  

在温和蛋白酶水解作用下，pol I被分解成两个肽段：

• 较大的片段为Klenow片段，具有DNA聚合酶活性和3'→5'核酸外切酶活性；
  
• 较小的片段具有5‘→3’核酸外切酶活性。
  

Taq聚合酶-DNA复合体的共结晶结构。其聚合酶结构域与Klenow片段十分相似。这看上去像是一只手，O helix和I helix这两个α螺旋分别为“四指”和“拇指”，二者之间具有一个结合DNA的裂缝，模板链和引物链分别用橙色和红色标注，引物链3'端靠近“手掌”中三个重要的天冬氨酸残基。图片来自参考资料[1]

无pol I活性的突变体仍然可以存活。pol I的功能主要是去除RNA引物，对复制中的错误进行校对，对复制和修复中出现的空隙进行填补。
1.2 DNA聚合酶Ⅱ

无pol II活性的突变体仍然可以存活。推测它是在pol I和pol III缺失情况下暂时起作用的酶，参与DNA损伤的应急状态修复。pol II具有DNA聚合酶活性和3'→5'核酸外切酶活性。
1.3 DNA聚合酶Ⅲ

DNA聚合酶Ⅲ通过延伸引物而合成前导链和后随链，每分钟可催化多至10^5次聚合反应，是复制延长过程中真正起催化作用的酶。
pol III含有10种（17个）亚基，包括：

• 2个核心酶（核心酶由α、ε、θ亚基组成），具有DNA聚合酶活性和3'→5'核酸外切酶活性
  
• 1对τ亚基（由2个τ亚基组成），连接γ复合物与核心酶
  
• 1对滑动夹（滑动夹由2个β亚基组成），可以夹稳模板链并使酶沿模板滑动
  
• 1个γ复合物（由5个亚基组成），又称夹子加载复合体(Clamp loader complex)
  

图片来自参考资料[1]



图片来自wiki，未画出滑动夹

2 真核生物的DNA聚合酶

真核细胞的DNA聚合酶至少有15种。哺乳动物主要的DNA聚合酶有：

• DNA聚合酶α：引物酶，为两条链合成引物；
  
• DNA聚合酶δ：延伸后随链；
  
• DNA聚合酶ε：延伸前导链；
  
• DNA聚合酶β：参与DNA修复；
  
• DNA聚合酶γ：负责线粒体DNA合成。
  

进行性(processivity) 是指聚合酶一旦起始复制后所能持续进行的趋势。Pol δ，Pol ε具有高进行性，这得益于辅助蛋白增殖细胞核抗原(PCNA)将聚合酶夹在DNA模板上。Pol β没有进行性，与修复功能匹配。
3 解旋酶

解旋酶(helicase) 是利用ATP化学能在复制叉处解离两条DNA亲本链的酶。为了鉴定出参与DNA复制的解旋酶，以下特点是支持的：

• 编码该酶的基因突变造成DNA合成中断，复制受阻；
  
• 该基因编码产物也具有ATP酶活性；
  
• 通过以下实验可证明解旋酶活性：
  

• 环形M13噬菌体DNA退火结合一段5'被标记的短线性DNA片段，作为底物；
  
• 将其与待测酶共温育；
  
• 电泳产物。
  

实验示意图。图片来自参考资料[1]



实验结果。泳道1为短线性DNA片段的对照组；泳道2为不加待测酶的对照组，两条带可能分别对应线性及环形底物；泳道3为加入待测酶DnaB的实验组，显示了3条条带，表明确实有解旋作用。图片来自参考资料[1]

实验表明E.coli dnaB基因编码的DnaB在E.coli DNA复制过程中发挥解旋酶活性。
4 单链DNA结合蛋白

原核生物中，单链DNA结合蛋白(Single strand DNA-binding protein,SSB) 选择性地与单链DNA结合，阻止单链DNA退火重新形成双螺旋，保护单链DNA免于降解。
SSB具有协同效应，即一个SSB的结合会促进下一个SSB的结合。



图片来自参考资料[2]

5 拓扑异构酶

DNA双链可形成超螺旋(supercoil)结构，就好比缠绕的电话线再次缠绕。盘绕方向与DNA双螺旋方向相同时为正超螺旋，反之为负超螺旋。



图片来自网络

B型DNA每个螺旋约有10个碱基对。如果DNA只固定一端，每解开10个碱基对（解开一个螺旋），DNA将会旋转一圈以释放张力。如果DNA两端固定或者是环形DNA，每解开10个碱基对DNA将会形成一个超螺旋结构。
DNA旋转一圈或者形成超螺旋结构显然不利于DNA复制。拓扑异构酶(topoisomerase) 可引起DNA单链或双链瞬间断裂而改变其形状或拓扑结构，由解旋酶引入的超螺旋可通过拓扑异构酶来消除。
原核生物的拓扑异构酶分为两类：

• Ⅰ型拓扑异构酶：切断DNA双链中的一条链，使DNA解链旋转时不至于打结，适当时候再将切口封闭。无需ATP（磷酸二酯键的能量被暂储存在酶活性位点的磷酸酪氨酸连接处）。
  
• Ⅱ型拓扑异构酶：又称促旋酶(gyrase)，切断处于正超螺旋状态的DNA双链，松弛超螺旋，然后消耗少量ATP催化连接切口。
  

Ⅱ型拓扑异构酶的作用。图片来自参考资料[2]

• 将松弛环状colE1 DNA与E.coli DNA促旋酶共温育，同时添加ATP、亚精胺（诱导DNA凝聚）和MgCl_2（镁离子参与促旋酶的催化作用）；
  
• 1h后电泳并用UV照射下发荧光的溴化乙啶进行染色。已知超螺旋数越多电泳迁移率越大。
  

泳道1：超螺旋colE1 DNA；泳道2：松弛colE1 DNA；泳道3~10：添加促旋酶，且促旋酶量逐渐增加，可见出现了迁移率更大的条带；泳道11：无ATP，泳道12：无亚精胺，泳道13：无氯化镁；泳道14：无ATP，超螺旋colE1 DNA+240ng促旋酶。图片来自参考资料[1]

参考资料

[1] Weaver, R. (2011) Molecular biology. 5th ed. New York: McGraw-Hill.（中译本：郑用琏等译，分子生物学（原书第五版），科学出版社）
[2] Watson, J., Gann, A., Baker, T., et al. (2013) Molecular biology of the gene. 7th ed.         New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. （中译本：杨焕明等译，基因的分子生物学（第六版），科学出版社）
[3] 周春燕、药立波主编，生物化学与分子生物学（第9版），人民卫生出版社.
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